炒炭对地榆中鞣质量及止血效果的影响

俞 浩，毛斌斌，刘汉珍

(安徽科技学院食品药品学院，安徽蚌埠 233100)

地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或长叶地榆 Sanguisorba of ficinalis L.var.Longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根，具有凉血止血，解毒敛疮之功效，主要用于便血、痔血、血痢、崩漏、水火烫伤、痈肿疮毒等证［1］。研究表明，地榆具有抗炎消肿、止血、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用［2-5］。地榆供临床应用有生地榆和地榆炭两个炮制品种，其中生地榆凉血止血，尤以凉血作用较强;地榆炭止血、收敛、止痢作用较生地榆显著增强［1］。当前，有关地榆炮制后鞣质含有量变化结果不一。本实验以安徽滁州产长叶地榆为研究对象，采用《中国药典》规定的炮制方法进行炮制，观察地榆炒炭前后鞣质的变化，并观察炮制对地榆止血作用的影响，对地榆炒炭止血合理性进行探讨。

1 材料

1.1 药品与试剂 地榆，采自安徽省凤阳县韭山，经安徽科技学院刘汉珍副教授鉴定为长叶地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根;没食子酸(北京仪化通标科技有限公司);干酪素 (上海诺泰化工有限公司);亚甲基蓝 (天津市科密欧化学试剂开发中心);凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间和纤维蛋白原测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器设备 TU1810型紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器公司);TDL-5离心机 (上海安亭科学仪器厂);数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公司);ACL200全自动血凝分析仪 (BECKMANH);体外血栓形成血小板粘附两用仪 (北京宏润达科技发展有限公司);FA21048电子天平 (上海市精密科学仪器总厂)。

1.3 实验动物 昆明种小鼠，体质量 (20±2)g，雌雄各半，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号为:SCXK(皖)2007-001;SD大鼠，体质量 (200±20)g，雌雄各半，由安徽省实验动物中心提供，许可证号:SCXK(皖)2011-002号。

2 方法

2.1 地榆炮制品的制备［6］生地榆:取地榆，洗净，除去残茎，润透，切厚片，干燥即得。地榆炭:取净地榆片，置热锅内，用武火炒至表面焦黑色，内部棕褐色，喷淋清水少许，熄灭火星，取出，晾干，得地榆炭。生地榆和地榆炭打成粗粉备用。

2.2 鞣质测定［6］

2.2.1 没食子酸对照品溶液的配制 精密称取没食子酸对照品10 mg，置200 mL棕色量瓶中，蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.05 mg/mL的没食子酸对照品溶液，备用。

2.2.2 标准曲线的制备 精密量取没食子酸对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水至13 mL，用29%Na2CO3溶液稀释并定容，摇匀，放置30 min。以相应试剂做空白，760 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，得标准曲线方程为 Y=85.0630X+0.0078，r2=0.9990，在 1 ～10 μg/L 范围内线性关系良好。

2.2.3 检测样品溶液的制备 精密称定生地榆或地榆炭粗粉1 g，置250 mL棕色量瓶中，加蒸馏水150 mL，放置过夜，超声处理10 min，放冷，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，待测。

总酚测定 精密量取检测样品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1 mL，加水10 mL，余步骤同“2.2.2”项下方法，计算没食子酸的量。

不被吸附多酚测定 精密称定干酪素0.6 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入检测样品溶液25 mL，密塞，置30℃恒温水浴摇床振荡1 h，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液。精密量取续滤液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1 mL，加水10 mL，余步骤同“2.2.2”项下方法，计算没食子酸量。鞣质量=总酚量－不被吸附的多酚量。

2.3 地榆炒炭前后吸附力测定［7-8］

2.3.1 亚甲基蓝标准溶液的配制 精密称取烘干至恒定质量的亚甲基蓝对照品40 mg，置500 mL的量瓶中，用pH7的磷酸缓冲液溶解并定容，得质量浓度为0.04 mg/mL的亚甲基蓝对照品溶液。

2.3.2 亚甲基蓝标准曲线的制备 精密量取亚甲基蓝对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置25 mL量瓶中，用pH7的磷酸盐缓冲液定容，摇匀。以相应的空白试剂作对照，670 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，亚甲基蓝质量浓度横坐标，得标准曲线方程为Y=0.06489X+0.0018，r2=0.9998，在 0.8 ～8.0 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.3 吸附力测定 精密称取生地榆和地榆炭粉末各0.1 g，置100 mL具塞锥形瓶中，分别加入亚甲基蓝标准溶液25 mL，置水浴恒温振动器上振荡120 min，滤过，取滤液。以磷酸缓冲溶液为空白对照，在670 nm处测定吸光度，计算吸附量和吸附力。吸附量=加入量－未被吸附量，吸附力=吸附量/样品量。

2.4 地榆炒炭前后止血凝血作用研究

2.4.1 地榆供试液的制备 称取生地榆或地榆炭50 g，分别加水500 mL，浸泡 8 h，武火煮沸，文火保持微沸30 min，过滤，取滤液，浓缩至100 mL，得质量浓度为0.2 g生药/mL的地榆或地榆炭水提液。试验时以生理盐水稀释至所需质量浓度。

地榆、地榆炭人临床用量为15 g，按60 kg体质量计，以生药量折算小鼠的等效剂量为2.25 g/kg体质量，大鼠等效剂量为1.75g/kg体质量。

2.4.2 地榆炒炭对小鼠出血时间的影响［7］取小鼠60只，随机分成6组，即生地榆高、低剂量组 (剂量分别为4.5、2.25 g/kg)，地榆炭高、低剂量组 (剂量分别为4.5、2.25 g/kg)，云南白药组 (剂量为0.4 g/kg)和空白对照组。灌胃给药，每日1次，连续7 d，灌胃容量均为20 mL/kg，空白对照组给等容量的生理盐水。末次给药后1 h，在距小鼠尾尖1 cm处用剪刀剪断尾尖，立即开始计时，并每隔30 s用滤纸擦拭断尾处1次，至滤纸上无血迹为止，记录出血时间。

2.4.3 地榆炒炭对小鼠凝血时间的影响［9-10］取小鼠60只，随机分成6组，即生地榆高、低剂量组 (剂量分别为4.5、2.25 g/kg)，地榆炭高、低剂量组 (剂量分别为4.5、2.25 g/kg)，云南白药组 (剂量为0.4 g/kg)和空白对照组。灌胃给药，每日 1次，连续 7 d，灌胃容量均为20 mL/kg，空白对照组给等容量的生理盐水。末次给药后1 h，小鼠眶后静脉丛采血，滴一滴血于洁净的载玻片上，立即计时，并每隔30 s用注射针头挑动1次，至有凝血丝出现时止，记录凝血时间。

2.4.4 地榆炒炭对大鼠体外血栓形成及凝血参数的影响［11-12］取大鼠60只，随机分成6组，即生地榆高、低剂量组 (剂量分别为3.5、1.75 g/kg)，地榆炭高、低剂量组(剂量分别为3.5、1.75 g/kg)，云南白药组 (剂量为0.3 g/kg)和空白对照组。灌胃给药，每日1次，连续7 d，灌胃容量均为5 mL/kg，空白对照组给等容量的生理盐水。

2.4.4.1 体外血栓长度和干、湿质量测定 末次给药后30 min，戊巴比妥钠 (剂量为30 mg/kg)麻醉大鼠，仰位固定，腹主动脉取血，取2 mL血液注入血栓管，立即将血栓管固定于体外血栓形成血小板粘附两用仪上，开启仪器，转动15 min，取下血栓管，将血栓倒在滤纸上，吸净血栓表面余血，测量血栓长度 (cm)，称血栓湿重。然后将血栓置64℃烘箱内干燥30 min，取出，称血栓干重。

2.4.4.2 凝血参数测定 大鼠腹主动脉采血，3.8%枸橼酸钠抗凝 (枸橼酸钠∶全血为1∶9，V/V)，取抗凝血，按照试剂盒说明书操作方法，采用全自动血凝仪测定凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间、凝血酶时间和纤维蛋白原含量。

3 结果

3.1 地榆炒炭前后鞣质的量及吸附力测定结果 由表1可知，生地榆鞣质含有量为8.92%，吸附力为0.98 mg/g，炒炭后鞣质含有量为11.16%，吸附力为1.41 mg/g。说明地榆炒炭后鞣质量增加，吸附力增强。

表1 地榆炒炭前后鞣质及吸附力测定结果 (n=5)

3.2 地榆炒炭对小鼠出血时间和凝血时间的影响 由表2可知，生地榆和地榆炭均能显著缩短小鼠的出血时间和凝血时间，与空白对照组比较具有显著性差异 (P＜0.01);地榆炭高、低剂量组小鼠的出血时间和凝血时间均显著低于相应剂量的生地榆 (P＜0.05或P＜0.01)。说明地榆具有很好的止血作用，炒炭后止血作用增强。

表2 地榆炒炭对小鼠出血时间和凝血时间的影响 (x ± s，n=10)

3.3 地榆炒炭对大鼠体外血栓长度和干、湿重的影响 由表3可知，生地榆高剂量组和地榆炭高、低剂量组大鼠血栓长度均显著高于空白对照组，差异具有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)，地榆炭的作用显著强于同等剂量的生地榆 (P＜0.05);生地榆和地榆炭均能显著增加大鼠血栓湿重和干重，与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)，地榆炭的作用显著强于同等剂量的生地榆(P＜0.01)。说明生能显著促进大鼠体外血栓的形成，炒炭后促进血栓形成作用更强。

表3 地榆炒炭前后对大鼠体外血栓长度和干、湿重的影响 (，n=10)

表3 地榆炒炭前后对大鼠体外血栓长度和干、湿重的影响 (，n=10)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与同等剂量的地榆炭比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

/g空白对照组 —组 别 剂量/(g·kg－1) 血栓长度/cm 血栓湿重×10－2/g 血栓干重×10－2 2.59±0.37 12.43±1.38 3.38±0.80云南白药组 0.3 3.58±0.56＊＊ 18.53±2.16＊＊ 4.99±0.54＊＊生地榆高剂量组 3.5 3.08±0.44＊△ 15.90±1.44＊＊△△ 4.06±0.58＊△△生地榆低剂量组 1.75 2.78±0.44△ 15.22±1.70＊＊△△ 3.97±0.37＊△△地榆炭高剂量组 3.5 3.54±0.54＊＊ 18.26±1.10＊＊ 4.86±0.71＊＊地榆炭低剂量组 1.75 3.22±0.43＊＊ 17.73±1.04＊＊ 4.43±0.56＊＊

3.4 地榆炒炭对大鼠凝血参数的影响 由表4可知，生地榆和地榆炭均能显著降低凝血原时间，与空白对照组比较具有显著性差异 (P＜0.01)，地榆炭的作用显著强于同等剂量的生地榆 (P＜0.01);生地榆高剂量和地榆炭高、低剂量均能显著升高纤维蛋白原含量，与空白对照组比较具有显著性差异 (P＜0.05或P＜0.01)，地榆炭的作用显著强于同等剂量的生地榆 (P＜0.05或P＜0.01);生地榆和地榆炭均能显著缩短活化部分凝血酶时间和凝血酶时间，与空白对照组比较具有显著性差异 (P＜0.01)，地榆炭高剂量作用显著强于生地榆高剂量 (P＜0.05)。说明具有促进凝血作用，炒炭后凝血作用增强。

表4 地榆炒炭对大鼠凝血参数的影响 (，n=10)

表4 地榆炒炭对大鼠凝血参数的影响 (，n=10)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与同等剂量的地榆炭比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

/s空白对照组 —组 别 剂量/(g·kg－1) 凝血酶原时间/s 纤维蛋白原/(g·L－1) 活化部分凝血酶时间/s 凝血酶时间13.32±1.38 6.86±0.91 27.75±3.96 19.17±1.88云南白药组 0.3 9.40±0.70＊＊ 10.41±1.12＊＊ 20.13±1.70＊＊ 14.32±2.58＊＊生地榆高剂量组 3.5 11.08±0.52＊＊△△ 7.90±0.90＊△ 23.32±2.33＊＊△ 16.34±1.44＊＊△生地榆低剂量组 1.75 11.48±0.97＊＊△△ 7.23±0.75△△ 24.27±2.29＊＊ 16.59±1.25＊＊地榆炭高剂量组 3.5 9.85±0.73＊＊ 9.12±0.79＊＊ 20.83±2.13＊＊ 14.42±1.95＊＊地榆炭低剂量组 1.75 10.60±0.98＊＊ 8.60±1.65＊＊ 22.09±2.83＊＊ 15.61±1.86＊＊

4 讨论

中药炒炭供临床应用是我国医药学的一大特色，炒炭的目的是使药物增强或产生止血作用，即“炒炭止血”理论。地榆为中医临床常用的止血药之一，清《本草分经》谓“止血炒黑用”［13］。鞣质具有收缩创面微血管，并能与创面渗出物中的蛋白质结合形成大分子，使创伤组织表面蛋白凝固，减少分泌与血浆渗出，并可在血管破损处形成硬块而发挥止血作用，由此可见，鞣质是中药止血的主要成分之一。当前，关于地榆炒炭后鞣质变化及止血效果的研究报道较多，但结果存在较大差异。有研究认为，地榆炒炭后鞣质含有量下降［14-15］。也有研究结果显示，地榆炒炭后鞣质含量增加，且能缩短小鼠出血时间［16-18］。

本实验采用《中国药典》2010年版规定方法制备了生地榆和地榆炭两个炮制品种，探讨了地榆炮制前后鞣质和吸附力的变化，观察了地榆炮制前后对小鼠出血时间和凝血时间的影响，并观察了对大鼠体外血栓形成和凝血参数的影响。实验结果显示，地榆炒炭后与收敛止血功效相关的成分鞣质含有量升高，吸附力增强;地榆炭组小鼠的出血时间和凝血时间均显著低于生地榆组;地榆炭能够抑制大鼠体外血栓的形成，缩短凝血酶原时间、凝血酶时间和活化部分凝血酶时间，升高纤维蛋白原含量，说明地榆炒炭后止血作用增强。本实验从地榆炒炭后鞣质含有量和止血效果变化揭示了地榆炒炭止血的合理性。有关地榆炒炭止血的机制及是否仅与鞣质的量的增加有关有待进一步深入研究。

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