吡格列酮对异氟醚麻醉引起的老年小鼠认知功能损伤的影响*

曹德雄， 李玉娟， 王 飞， 苏兴文， 曹 林△

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是发生于手术后以意识障碍、学习记忆力下降为特点的临床综合症，多见于老年病人，可持续数周、数年甚至终身，严重影响了患者的最终恢复并增加了患者的死亡率［1］。吸入麻醉药是目前广泛用于临床手术的全麻药，我们及其他学者的实验研究证明，异氟醚，一种常用的吸入麻醉药，可以引起啮齿类动物的认知功能损伤［2-3］，也有临床研究报道异氟醚麻醉增加了病人POCD的发生率［4］，提示吸入麻醉药可能对POCD的发生起着一定的作用，所以，寻找干预吸入麻醉药引起认知功能障碍的方法具有重要的临床意义。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)属于核激素受体，广泛分布在中枢神经系统的各种细胞中［5］。PPARγ激动剂具有神经保护作用，可以减轻多种中枢神经系统疾病的发生发展［5-6］。近年来的研究显示:在多种认知功能障碍的动物模型中，预先给予PPARγ激动剂可以改善动物的认知功能［7-8］;临床的调查研究也发现，PPARγ激动剂可以改善阿尔海默氏病早期的认知功能［9］。那么，PPARγ激动剂是否也可以缓解异氟醚引起的认知功能障碍呢?目前未见文献报道。另外，我们前期的研究证明了炎症细胞因子白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)介导了异氟醚引起的啮齿类动物的认知功能障碍［3］。所以，我们在前期的工作基础上，研究了吡格列酮(pioglitazone，Pi)，一种高选择性的PPARγ激动剂，对异氟醚引起老年小鼠认知功能障碍的影响及其对小鼠脑组织中炎症细胞因子的影响。

材料和方法

1 材料

1.1 主要仪器与试剂 麻醉气体检测仪(Datex)，血气分析仪(拜尔)，异氟醚(雅培制药有限公司)，吡格列酮、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)和蛋白酶抑制剂(Sigma)，小鼠PPARγ单克隆抗体(Santa Cruz)，兔β-actin多克隆抗体(Sigma)，羊抗小鼠Ⅱ抗、羊抗兔Ⅱ抗(武汉博士德公司)，Bradford蛋白浓度检测试剂(Bio-Rad)，IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒(R＆D Systems)。

1.2 动物及分组 136只11个月大的雄性C57BL/6J小鼠随机分成5组:对照组(control，Con)、异氟醚组(isoflurane，Iso)、吡格列酮(10 mg/kg)+异氟醚组(Pi10+Iso)、吡格列酮(20 mg/kg)+异氟醚组(Pi20+Iso)和单纯吡格列酮(20 mg/kg)组(Pi20)，除Pi10+Iso组24只外，余各组28只。多数动物在异氟醚处理结束后48 h，进行恐惧记忆实验(fear conditioning);部分动物在异氟醚处理结束后6 h分离大脑皮质和海马，用于检测PPARγ蛋白的表达以及炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的量;每组4只动物在异氟醚处理结束即刻经左心室心脏穿刺抽血行血气分析。

2 方法

2.1 异氟醚暴露 参照我们前期的方法［10］，将小鼠放置于一麻醉箱中，该麻醉箱放置于预设温度为37℃的水浴箱中。麻醉箱进气口与装有异氟醚挥发罐的麻醉机连接，出气口接延长管置于通风厨。1.4%异氟醚由氧气输送通过该麻醉箱，使用气体监测仪监测小鼠呼气末的异氟醚、氧气和二氧化碳浓度。异氟醚暴露2 h后，停止吸入异氟醚。Con组和Pi20组中的小鼠放置于相同的麻醉箱中，仅吸氧2 h。

2.2 吡格列酮给药 小鼠在异氟醚暴露前2 h，灌胃给予10 mg/kg或20 mg/kg吡格列酮。吡格列酮溶于1%CMC，给药容量为10 mL/kg。Con组和Iso组中的小鼠给予相同容量的1%CMC。

2.3 生理指标监测 麻醉过程中每隔15 min观察小鼠的唇色，记录呼吸频率，在麻醉结束时即刻，每组各4只小鼠经左心室心脏穿刺抽血行血气分析。

2.4 恐惧记忆实验 参照我们以前的方法［3］，异氟醚处理后48 h，动物用于恐惧记忆行为实验。每只动物被放入一个由70%乙醇擦拭过的测试箱中，箱子放置于相对黑暗的空间，动物遭受3次噪声+足部电击(噪声:2 000 Hz，85 dB，30 s;足部电击:1 mA，2 s)，每次间隔1 min，电击是通过测试箱底部的不锈钢栅传给动物的，噪声则由安装在测试箱顶部的扬声器发出。完成训练后，动物在测试箱中恢复1 min，然后将动物放回饲养笼。24 h后，进行情景恐惧记忆测试(context):将动物放回相同的箱子呆5 min，但是没有噪声和电击，每6 s记录僵住(freezing)行为(即动物除了呼吸运动外，全身其它躯体运动全部停止的状态)。每只动物发生僵住行为的百分比按以下公式计算:100×N/T，N指动物发生僵住行为的次数，T指可能发生僵住行为的总次数。2 h后，进行声音提示的恐惧记忆测试(tone):动物被放置于一个场景、形状和气味不同于第1个箱子的测试箱中(这个箱子用1%醋酸擦拭)，该箱子放置在相对明亮的空间。首先动物在这个新箱子中适应2 min，然后，开始3个循环的噪声刺激，每个循环持续30 s，接着是1 min的间歇期(总共4.5 min)，在这4.5 min内每6 s记录动物的僵住行为。僵住行为由摄像头录像，由1名不知道实验分组的人员观察记录。这套实验用于检测情景相关(context-related)和声音相关(tone-related)的学习和记忆功能。

2.5 脑组织样本的收集 参照我们前期的方法［3］，异氟醚暴露结束后6 h，动物在异氟醚深麻醉下用生理盐水行心脏灌注后，断头，在冰上迅速分离海马和皮质，用于检测PPARγ蛋白的表达、炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的量。

2.6 Western blotting法检测PPARγ蛋白的表达新鲜冰冻的脑组织匀浆后提取蛋白，根据蛋白浓度，各样本等量蛋白10%SDS-PAGE电泳，转膜，1∶500 PPARγ小鼠单克隆抗体、1∶2 000兔抗β-actin 4℃孵育过夜，1∶2 000Ⅱ抗室温孵育2 h，使用ECL(Amersham)进行胶片显影。

2.7 ELISA法检测IL-1β和TNF-α的量 参照我们前期的方法［3］，分离出的脑组织在冰上用含有蛋白酶抑制剂(10 g/L抑肽酶，5 g/L胃蛋白酶抑制剂，5 g/L亮肽素和1 mmol/L PMSF)的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)匀浆，匀浆液在4℃下以13 000×g离心20 min，收集上清，Bradford蛋白浓度检测试剂检测每个样本的蛋白浓度。按照说明书，用检测IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒来定量样品中的这些细胞因子的含量。每个脑组织样品中的IL-1β和TNF-α的表达都标准化为蛋白含量。

3 统计学处理

计量资料以均数±标准差 (mean±SD)表示，用GraphPad Prism 6统计软件处理，组间比较采用随机区组设计的单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠麻醉时生理指标的检测

各组小鼠在麻醉处理过程中唇色红润，呼吸均匀，没有出现呼吸抑制。各组的pH值均在正常范围内，各组比较无明显差异(P＞0.05)。各组均无缺氧表现及二氧化碳蓄积，各组比较PO2与PCO2无明显差异(P ＞0.05)，见表1。

表1 各组小鼠麻醉时血气分析结果Table 1.Isoflurane exposure did not affect arterial blood gas values significantly(Mean±SD.n=4)

2 小鼠恐惧记忆行为测试结果

2.1 情景恐惧记忆测试 与Con组比较，Iso组小鼠的僵住行为明显减少(P＜0.05);与Iso组比较，Pi10+Iso组小鼠的僵住行为虽有增加的趋势，但差异不明显(P＞0.05)，而Pi20+Iso组小鼠的僵住行为增加明显(P＜0.05);单纯Pi20组小鼠的僵住行为与Con组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1A。这提示异氟醚损伤了小鼠情景相关的学习记忆功能，吡格列酮随着剂量的增加可以减轻异氟醚引起的小鼠认知障碍。

2.2 声音提示恐惧记忆测试 与Con组比较，Iso组小鼠的僵住行为明显减少(P＜0.05);与Iso组比较，Pi10+Iso组小鼠的僵住行为虽有增加的趋势，但差异不明显(P＞0.05)，而Pi20+Iso组小鼠的僵住行为增加明显(P＜0.05);单纯Pi20组小鼠的僵住行为与Con组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1B。这提示异氟醚损伤了小鼠声音提示相关的学习记忆功能，吡格列酮随着剂量的增加可以减轻异氟醚引起的小鼠认知障碍。

3 小鼠脑组织中PPARγ蛋白的变化

与Con组比较，Iso组皮质和海马中PPARγ蛋白的表达无明显变化(P＞0.05);与Iso组比较，Pi10+Iso组皮质和海马中PPARγ蛋白的表达虽有增加的趋势，但差异不明显(P＞0.05)，而Pi20+Iso组和Pi20组皮质和海马中PPARγ蛋白的表达明显增加(P＜0.05)，见图2。这提示吡格列酮随着剂量的增加可以增加小鼠脑组织中PPARγ蛋白的表达。

Figure 1.Cognitive functions assessed by fear conditioning.Eleven-month-old male C57BL/6J mice were exposed to or not exposed to 1.4%isoflurane for 2 h with or without 10 mg/kg or 20 mg/kg pioglitazone pretreatment and then subjected to the fear conditioning test 48 h later.A:context fear;B:tone fear.Mean ± SD.n=16.*P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs Iso group.图1 各组小鼠恐惧记忆实验结果

Figure 2. PPARγ protein expression in mouse brain tissues.Eleven-month-old male C57BL/6J mice were exposed to or not exposed to 1.4%isoflurane for 2 h with or without 10 mg/kg or 20 mg/kg pioglitazone pretreatment.Hippocampus and cerebral cortex were harvested 6 h after anesthetic exposure for Western blotting analysis of PPARγ protein expression.Mean±SD.n=4.*P ＜0.05 vs Iso group.图2 各组小鼠脑组织中PPARγ蛋白的表达

4 小鼠脑组织中IL-1β的变化

4.1 皮质IL-1β的变化 各组皮质IL-1β的差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3A。

4.2 海马IL-1β的变化 Iso组海马IL-1β的水平比Con组增加 (P＜0.05)，Pi20+Iso组 IL-1β的含量比Iso组减少 (P＜0.05)，而Pi20组与Con组比较，IL-1β的含量差异无统计学意义，见图3B。这提示异氟醚增加了小鼠海马中炎症细胞因子IL-1β的表达，20 mg/kg吡格列酮可以抑制异氟醚引起的IL-1β含量的增加。

5 小鼠脑组织中TNF-α的变化

5.1 皮质TNF-α的变化 各组皮质TNF-α差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3C。

5.2 海马TNF-α的变化 各组海马TNF-α差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3D。

讨 论

学习和记忆功能是认知功能的重要方面。为了研究吡格列酮对异氟醚引起老年小鼠认知功能障碍的影响，本研究采用了恐惧记忆实验来检测动物的认知功能。恐惧记忆实验是用来评估关联性的学习记忆功能的测试，是研究麻醉或麻醉手术引起的认知功能障碍中最常用的行为学测试［3，11-12］。实验结果显示异氟醚减少了老年小鼠在情景恐惧记忆测试和声音提示恐惧记忆测试中的僵住行为，表明异氟醚损伤了老年小鼠的认知功能;而吡格列酮，随着其剂量的增加减轻了异氟醚引起的老年小鼠的认知功能障碍。

本研究中我们选用1.4%异氟醚麻醉2 h是因为小鼠异氟醚的最小肺泡浓度(minimum alveolar concentration，MAC;指50%的动物对疼痛刺激无体动反应的肺泡浓度)为1.4%［13］，而且临床上多数手术全麻时吸入麻醉药的浓度维持在0.5～1.3信MAC，麻醉时间在2 h以上，所以，我们的研究结果表明按临床相关的方法使用异氟醚，可以损伤老年小鼠的认知功能。这一结果与我们前期及其他学者的研究结果一致［2-3］。然而，也有研究显示异氟醚对啮齿类动物的认知功能无影响，甚至可以改善认知功能，尤其是在使用年轻的成年动物时［14-15］，这可能与不同研究中，异氟醚的使用浓度、作用时间的长短，进行认知功能测试的时间及不同的测试方法有关。体温不稳定、缺氧和高碳酸血症可以影响认知功能［16］，所以我们在异氟醚麻醉期间对动物保暖，并且血气分析结果显示各组动物的pH值、PaO2和PaCO2无明显差异，从而排除了这些生理因素对实验结果的影响。

Figure 3.IL-1β (A，B)and TNF-α (C，D)contents in mouse brain tissues.Eleven-month-old male C57BL/6J mice were exposed to or not exposed to 1.4%isoflurane for 2 h with or without 20 mg/kg pioglitazone pretreatment.Hippocampus(B，D)and cerebral cortex(A，C)were harvested 6 h after anesthetic exposure for ELISA of IL-1β and TNF-α contents.Mean ± SD.n=8.*P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs Iso group.图3 各组小鼠脑内IL-1β和TNF-α的含量

吡格列酮属于噻唑烷酮类化合物，是临床上治疗Ⅱ型糖尿病的主要药物，也是PPARγ特异性激动剂，使其与核内的维甲酸X受体结合形成异源二聚体，再与靶基因启动子中的PPAR反应元件结合，导致DNA转录，转录合成后的蛋白酶通过不同的信号通路参与多种生理作用［5］。吡格列酮可以减轻中枢神经系统的缺血性损伤［5］，也可以减轻中枢神经系统退行性病变如帕金森氏病的发展［6］。最近有动物实验显示吡格列酮可以减轻东莨菪碱引起的认知损伤［7］，也有研究证明吡格列酮减轻了吗啡诱导的小鼠认知功能障碍［8］。本研究中我们观察了不同剂量吡格列酮(0、10和20 mg/kg)对异氟醚认知损伤的影响及脑组织中PPARγ的表达水平的影响。结果显示:吡格列酮随着剂量的增加，有逐渐减轻异氟醚引起认知损伤的趋势和增加脑组织中PPARγ表达的趋势;当吡格列酮的剂量增加到20 mg/kg时，异氟醚引起的认知损伤明显减轻，同时PPARγ表达水平明显增加。由于Iso组与Con组比较，PPARγ表达水平没有差异，说明异氟醚引起的认知损伤不一定与PPARγ的激活有关;而单独使用20 mg/kg吡格列酮或合用异氟醚都可以增加PPARγ的表达，说明吡格列酮改善认知功能损伤可能与PPARγ表达的增加有关。

异氟醚引起认知功能损伤的机制目前尚未完全明确，有研究证明神经炎症反应可以损伤认知功能［17］。IL-1β和TNF-α是主要的炎症细胞因子。实验证明IL-1β可以引起认知功能损伤［18］。我们前期的研究发现:异氟醚麻醉可以增加啮齿类动物海马IL-1β的水平并损伤其认知功能，却不损伤IL-1β缺乏小鼠的认知功能，表明IL-1β介导了异氟醚引起的认知损伤［3］。在对小鼠行胫骨开放性手术后认知功能障碍的研究中也发现，小鼠海马中IL-1β水平明显增加，而预先使用IL-1受体拮抗剂抑制IL-1β的作用可以减轻小鼠的术后认知功能障碍［13］。以上的研究表明IL-1β水平的增加在麻醉或手术后认知功能障碍的发生中起着关键作用。本研究中，异氟醚麻醉引起了老年小鼠认知功能障碍，也引起了海马IL-1β的增加，而20 mg/kg吡格列酮在减轻异氟醚引起认知损伤的同时，也抑制了异氟醚引起的IL-1β水平的增加，再次证明了IL-1β在异氟醚引起的认知损伤中起着重要作用。与我们前期［3，19］及其他学者［13，20］的研究结果一致，本研究中异氟醚没有引起小鼠皮质IL-1β的变化，这可能由于海马比皮质对异氟醚更为敏感所致。TNF-α在认知功能中的作用尚无定论，有研究认为TNF-α启动了细胞因子的级联反应而导致小鼠的术后认知功能下降［12］，也有研究显示TNF-α在炎症反应引起的认知损伤中无明显作用［21］。本研究中，我们没有观察到异氟醚处理后6 h小鼠海马和皮质中 TNF-α的改变，与我们前期［3，19］及其他学者［13，20］的研究结果一致，但是我们可能需要检测其它时点的TNF-α来确定异氟醚对TNF-α表达的影响和TNF-α在异氟醚引起认知损伤中的作用。

虽然目前我们并不清楚异氟醚是如何引起脑内IL-1β增加的，但是最近有研究证明:异氟醚可以引起神经细胞 NF-κB 的激活［22］。而 NF-κB 的激活可以增加细胞因子的产生［23］，所以我们推测异氟醚可能是通过激活NF-κB而增加了细胞因子IL-1β的水平。另一方面，NF-κB是一种核转录因子，是核激素受体PPARγ的靶目标，PPARγ的激活可以抑制NF-κB的转录活性，从而减少其下游一些重要炎症细胞因子如IL-1β的表达［24］。本研究中，20 mg/kg吡格列酮增加了老年小鼠脑组织中PPARγ蛋白，也抑制了异氟醚引起的IL-1β的增加，那么吡格列酮是否通过PPARγ抑制了异氟醚引起的IL-1β水平的增加，从而减轻了异氟醚引起的认知功能障碍呢?有待于我们进一步研究。

本研究也存在一定的局限性，没有使用PPARγ的拮抗剂来进一步证实吡格列酮是通过PPARγ来减轻异氟醚引起的认知功能障碍，没有确定PPARγ与IL-1β表达水平之间的因果关系，我们在后续的研究中将继续完善。总之，本研究结果证明了吡格列酮可以减轻异氟醚引起的老年小鼠的认知功能障碍，其机制可能是增加了脑组织中PPARγ蛋白的表达并抑制了异氟醚引起的IL-1β水平增高。

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