乳酸菌发酵对武夷岩茶咖啡因含量的影响及活性评价

许原+吕峰+刘崇禧

摘要：为探明乳酸菌发酵对武夷岩茶主要功能成分的的影响，试验采用超声波辅助萃取和适宜的乳酸菌发酵技术，制备岩茶萃取液和岩茶发酵液，通过HPLC定量分析研究乳酸菌发酵前后武夷岩茶中咖啡因的变化。结果表明，当接种量为6.8×103 CFU/mL，乳酸菌发酵岩茶中咖啡因含量最高达到16.76 mg/g，随着乳酸菌接种量的继续增加，咖啡因含量下降趋势不明显，进行螯合FEC的能力评价结果表明武夷岩茶具有较高的抗氧化活性。

关键词：乳酸菌发酵；武夷岩茶；咖啡因；螯合FEC能力

中图分类号：S571.1；TS201.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4399-03

茶叶中含有多种生理活性物质，使之具有抗氧化、抗疲劳、降血脂、降血糖、降血压、预防心脑血管病等功效，是人们日常生活的理想保健饮品[1-3]。经乳酸菌发酵的茶饮料，既具茶的清香，又具有醇香，营养丰富，酸甜适宜，风味独特，可增强茶饮料的保健作用，延长茶饮料的保存期[4-6]。目前，市面上已开发的茶饮料如康师傅红茶、绿茶等茶饮料主要是以红茶和绿茶为主。武夷岩茶是中国乌龙茶中之极品，具有红茶之甘醇，绿茶之清香，岩骨花香之岩韵。以武夷岩茶开发的乳酸菌茶饮料的研究尚未见报道。

本试验选择茶中主要活性成分咖啡因，建立其高效液相色谱分析条件，分析不同浓度和接种量下岩茶乳酸菌发酵前后活性成分的变化，考察乳酸菌发酵对武夷岩茶活性成分的影响以及对清除DPPH·、O2-·能力的影响。对于开发保留岩茶的活性物质，又赋于乳酸菌独特风味和保健功效的武夷茶饮料，具有一定的现实指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用武夷岩茶（肉桂）由武夷山琪明茶叶科学研究所提供。

Streptococcus thermophilus BCRC14086乳酸菌（台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心）；葡萄糖（分析纯）；没食子酸标准品；咖啡因标准品；乙腈（色谱纯），水为二次去离子水。

1.2 主要设备

EYZLAN-100型真空减压浓缩机；TOMINAGADC-200型超声波振荡水浴；FD-5240型棚架式冷冻干燥机；INCUBATOR恒温培养箱；AL204型电子天平；WATERS高压液相色谱仪。

1.3 试验方法

1.3.1 茶叶萃取、乳酸菌菌液制备、茶叶萃取物乳酸菌发酵 茶叶萃取、乳酸菌菌液制备、茶叶萃取物乳酸菌发酵参考许原[6]武夷岩茶乳酸菌发酵饮料开发研究步骤进行试验。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：Waters Symmetry Shield RP18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.05%磷酸∶乙腈=85∶15（V/V）；色谱柱温：室温；进样量：20 μL；流速：0.7 mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：280 nm。

1.3.3 标准曲线绘制[7，8] 标准溶液的配制：准确称取咖啡因标准品50 mg，用乙腈定容至50 mL，作为标准储备液待用。分别配制6.25、12.50、25.00、50.00 mg/L标准溶液。以咖啡因浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线为Y=36 432X-13 613，R=0.999 9。

1.3.4 螯合FEC能力评价 参考许原[6]、Dinis等[9]的方法，各取1.00 mL不同浓度的岩茶萃取液（250、500、1 000、2 000、4 000 mg/L），加入3.70 mL Tris-HCl 缓冲溶液（50 mmol/L，pH 7.4）及0.10 mL 2 mmol/L的FeCl2，在室温下静置10 min后，于562 nm波长下测其吸光度。

按下式计算螯合FEC能力：

2 结果与分析

2.1 发酵时间对乳酸菌活性的影响

按“1.3.1”的方法测得不同发酵时间下乳酸活菌数，结果见图1。Streptococcus thermophilus BCRC

14086乳酸菌最适宜培养温度为37 ℃，在37 ℃培养温度下，空白样和岩茶发酵液两种样品均在发酵时间为48 h时，乳酸菌活菌数最高，分别为4.01×1010 CFU/mL和2.24×109 CFU/mL。

2.2 乳酸菌发酵对咖啡因含量的影响

2.2.1 咖啡因标准品的HPLC色谱图 测得咖啡因标准品的HPLC色谱图见图2。由图2可以看出，采用0.05%磷酸∶乙腈=85∶15（V/V）流动相分析时，各谱图基线相对较稳，在保留时间约10.546 min出现明显的咖啡因峰形，且各组分峰与杂质峰明显分开，峰形尖锐，分离度较好。

2.2.2 岩茶咖啡因HPLC色谱图 岩茶储备液中咖啡因的HPLC色谱图见图3。由图3可以看出，岩茶储备液在保留时间为10.561 min时出现咖啡因峰形，且与杂质峰明显分开，峰形尖锐。

2.2.3 岩茶乳酸菌发酵液咖啡因HPLC色谱图 岩茶乳酸菌发酵液中咖啡因的HPLC色谱图见图4。由图4可以看出，岩茶乳酸发酵液在保留时间为10.552 min时出现咖啡因峰形，且与杂质峰明显分开，峰形尖锐。

2.2.4 乳酸菌发酵对岩茶咖啡因含量的变化 测得岩茶储备液和不同接种量的岩茶乳酸菌发酵液中咖啡因的含量见图5。由图5可知，随着乳酸菌接种量的增加，咖啡因含量呈下降趋势。咖啡因含量降低的原因可能是因为发酵过程促使咖啡因与多元酚类结合成为复合物的结果。

2.2.5 螯合FEC能力评价测定 按“1.3.4”的方法测得不同浓度岩茶萃取液及其乳酸菌发酵液螯合FEC的能力见图6。由图6可知在0～4 000 mg/L浓度范围内，岩茶萃取液和岩茶乳酸菌发酵液对Fe2+有螯合能力，在浓度为4 000 mg/L时，岩茶萃取液对Fe2+的螯合能力高达85.67%，岩茶乳酸菌发酵液对Fe2+的螯合能力高达80.13%，说明二者均对Fe2+具有较高的螯合能力。为了进一步分析岩茶液乳酸菌发酵前后抗氧化活性的差异，分别对发酵前后螯合FEC的能力作t检验（N=5）。经对比差异分析，表明岩茶液乳酸菌发酵前后的主要抗氧化活性具有显著性差异。

3 结论

1）武夷岩茶经超声波萃取后，用活化的Streptococcus thermophilus乳酸菌接种，在37 ℃发酵温度下，最佳发酵时间为48 h，此时乳酸菌活性最高，乳酸菌活菌数为2.24×109 CFU/mL。

2） 当接种量为6.8×103 CFU/mL，岩茶乳酸菌发酵液中咖啡因含量最高为16.76 mg/g，并且随着乳酸菌接种量的增加，咖啡因含量下降趋势不明显，这表明乳酸菌发酵对岩茶中咖啡因含量影响不大。因此可通过适当控制接种量，既保证乳酸菌发酵茶叶的有效营养成分，又保持乳酸菌较高的活性。

3）不同浓度的岩茶萃取物添加到乳酸菌发酵后，其螯合FEC能力与发酵前比较微有降低。因为伴随乳酸菌发酵的进行，茶中儿茶素、茶黄素等物质在多酚氧化酶和过氧化物酶的作用下发生了不同程度的氧化聚合而有一定的消耗，从而使其抗氧化活性有一定程度的降低。

参考文献：

[1] 张瑞莲，尹军峰，袁海波，等.基于主成分分析法研究茶叶加工工艺对茶饮料汤色稳定性的影响[J].食品科学，2010，31（13）：82-87.

[2] 陈 晶，郭荣荣，张 江.液态茶饮料加工技术现状及展望[J].安徽农业科学，2010，38（13）：6893-6895.

[3] 尹军峰，许勇泉，袁海波.中国大陆液态茶饮料发展趋势及主要技术需求分析[J].茶叶科学，2010，30（1）：588-592.

[4] 王 霞，高 云.乳酸菌茶饮料的研制[J].食品科学，2002，23（8）：206-208.

[5] 张一江.茶味乳酸菌饮料的研制[J].食品研究与开发，2009，25（1）：71-73.

[6] 许 原.武夷岩茶乳酸菌发酵饮料开发研究[D].福州：福建农林大学，2011.

[7] 吕海鹏，谭俊峰，郭丽.等.绿茶中的GCG研究[J].茶叶科学，2008，28（2）：79-82.

[8] 谷勋刚，蔡继宝，张正竹，等.HPLC-DAD分析红茶儿茶素类物质和咖啡因的方法研究[J].安徽农业大学学报，2010，37（1）：5-10.

[9] DINIS T C，MADERIA V M， ALMEIDA L M. Action of phenolic derivatives（acetaminophen， salicylate， and 5-aminosalicylate） as inhibitor of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical scavengers[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，1994， 315：161-169.

3 结论

1）武夷岩茶经超声波萃取后，用活化的Streptococcus thermophilus乳酸菌接种，在37 ℃发酵温度下，最佳发酵时间为48 h，此时乳酸菌活性最高，乳酸菌活菌数为2.24×109 CFU/mL。

2） 当接种量为6.8×103 CFU/mL，岩茶乳酸菌发酵液中咖啡因含量最高为16.76 mg/g，并且随着乳酸菌接种量的增加，咖啡因含量下降趋势不明显，这表明乳酸菌发酵对岩茶中咖啡因含量影响不大。因此可通过适当控制接种量，既保证乳酸菌发酵茶叶的有效营养成分，又保持乳酸菌较高的活性。

3）不同浓度的岩茶萃取物添加到乳酸菌发酵后，其螯合FEC能力与发酵前比较微有降低。因为伴随乳酸菌发酵的进行，茶中儿茶素、茶黄素等物质在多酚氧化酶和过氧化物酶的作用下发生了不同程度的氧化聚合而有一定的消耗，从而使其抗氧化活性有一定程度的降低。

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3 结论

1）武夷岩茶经超声波萃取后，用活化的Streptococcus thermophilus乳酸菌接种，在37 ℃发酵温度下，最佳发酵时间为48 h，此时乳酸菌活性最高，乳酸菌活菌数为2.24×109 CFU/mL。

2） 当接种量为6.8×103 CFU/mL，岩茶乳酸菌发酵液中咖啡因含量最高为16.76 mg/g，并且随着乳酸菌接种量的增加，咖啡因含量下降趋势不明显，这表明乳酸菌发酵对岩茶中咖啡因含量影响不大。因此可通过适当控制接种量，既保证乳酸菌发酵茶叶的有效营养成分，又保持乳酸菌较高的活性。

3）不同浓度的岩茶萃取物添加到乳酸菌发酵后，其螯合FEC能力与发酵前比较微有降低。因为伴随乳酸菌发酵的进行，茶中儿茶素、茶黄素等物质在多酚氧化酶和过氧化物酶的作用下发生了不同程度的氧化聚合而有一定的消耗，从而使其抗氧化活性有一定程度的降低。

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