热纤梭菌内切β—1，4—葡聚糖酶的克隆与表达

彭静静

摘要：将来源于热纤梭菌（Clostridium thermocellum）ATCC 27405的编码内切β-1，4-葡聚糖酶的结构基因（celD）与热激表达载体pHsh连接，得到重组表达载体pHsh-celD，并将重组表达载体pHsh-celD转入到大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中。结果表明，该重组酶的分子质量为66 ku，与预期大小相符。基于表达载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点，且重组酶热稳定性非常好，对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。

关键词：热纤梭菌（Clostridium thermocellum）；纤维素酶；表达载体pHsh；克隆；表达

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4457-03

纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶，能分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，水解成为葡萄糖[1]。随着纤维素酶在工业上广泛地应用，特别是在纺织工业、能源工业中，纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。热纤梭菌（Clostridium thermocellum）ATCC 27405是一种高温厌氧细菌，其合成的纤维素酶和半纤维素酶构成多酶复合体，纤维素酶主要是由内切β-1，4-葡聚糖酶（C1酶）、外切β-l，4-葡聚糖酶（Cx酶）和葡萄糖苷酶3种酶组成的。其中，内切β-l，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）是分解纤维素最主要的酶。嗜热梭菌（Clostridium sp.）产生的纤维素酶耐热性好，但是由于热纤梭菌是一种严格的厌氧菌，培养条件极其苛刻，分泌纤维素酶必须在高度厌氧的条件下进行，且酶产量相对较低，不适合在工业中大规模发酵生产。而采用分子生物学手段，将嗜热酶基因导入大肠杆菌（Escherichia coli）中高效表达是非常有效的方法[2-5]。

本试验克隆了编码内切β-1，4-葡聚糖酶的结构基因（celD），并连接到热激表达载体pHsh上，得到重组质粒pHsh-celD，并实现了此纤维素酶在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中高效表达，为该酶在工业上的开发及利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

热纤梭菌ATCC 27405（购于美国菌种保藏中心）采用厌氧培养基培养，55 ℃静置培养8 h[6，7]。表达载体pHsh由泰山学院生物与酿酒工程学院构建并保存，属于热激表达载体。该表达载体是由大肠杆菌σ32因子调控，包括一个热激启动子和终止子，通过热激诱导外源基因表达[8，9]。

1.2 方法

1.2.1 celD基因的克隆与重组表达载体的构建 根据GenBank上已提交的热纤梭菌ATCC 27405纤维素酶基因（NC_009012）的序列，利用信号肽预测利用在线SignalP 3.0软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）设计了PCR扩增引物N-1：5′-AGACCAAAGTGTCAGCTGC-3′和C-1：5′-CCCCTCGAGTATTGGTAATTTCTCGATTAC-3′。以提取的热纤梭菌ATCC 27405的基因组DNA为模板，进行PCR扩增celD基因。PCR扩增程序为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性25 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测正确后，切胶回收纯化目的DNA片段。将经Xho I酶切PCR回收产物和经Stu I和Xho I双酶切的表达载体pHsh连接，将连接产物电击转化入大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，构建含celD基因的重组表达载体pHsh-celD。

1.2.2 重组蛋白的表达与纯化 重组质粒pHsh-celD电转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，挑取重组单菌落接种于含100 μg/mL的Amp的LB培养液中30 ℃振荡培养。当培养至OD600 nm为0.6～0.8时转入42 ℃水浴摇床进行热激表达继续培养8 h后离心收集菌体。用50 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤细胞2次后，用相同缓冲液重悬细胞，置于冰浴中用超声波破碎仪破碎细胞。细胞碎片于12 000 r/min离心10 min，去除上清液即为粗酶液。将粗酶液在60 ℃热处理30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心30 min去除变性蛋白。

2 结果与分析

2.1 celD基因的克隆与序列分析

热纤梭菌ATCC 27405于厌氧管中55 ℃静置培养8 h后，提取基因组DNA，并经琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1A所示。根据GenBank上已提交的热纤梭菌ATCC 27405纤维素酶基因（NC_009012）的序列大小为1 950 bp，PCR扩增celD基因的结果如图1B所示，PCR扩增片段与预期大小（1 848 bp）相符。

2.2 重组表达载体pHsh-celD的构建

PCR扩增得到celD基因片段经Xho I单酶切后纯化，与经过Stu I和Xho I双酶切的表达载体pHsh连接，得到重组表达载体pHsh-celD，其酶切鉴定结果如图2所示。

2.3 重组纤维素酶的表达及检测

将重组表达载体pHsh-celD电转化到大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，挑取重组单菌落接种于含100 μg/mL Amp的LB培养液中30 ℃振荡培养。当培养至OD600 nm为0.6～0.8时转入42 ℃水浴摇床进行热激表达继续培养8 h后离心收集菌体。SDS-PAGE分析结果（图3）表明，重组菌均能产生约66 ku的特异条带，与预期的蛋白质相对分子质量大小一致。endprint

3 小结与讨论

本研究采用了热激载体pHsh作为表达载体，将来源于热纤梭菌的内切β-1，4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中成功表达。该表达载体是由大肠杆菌σ32因子调控，包括一个热激启动子和终止子，通过热激就可以高效地表达外源基因，所以在诱导外源基因表达过程中就不需要加入化学诱导剂。化学诱导剂如IPTG比较昂贵，是基因工程菌株在工业化应用中的一个瓶颈问题，而热激诱导能很好地降低了基因诱导表达成本，这无疑在工业化应用中具有巨大的优越性和现实意义[9，10]。本研究中利用热纤梭菌的纤维素酶耐热性，将重组菌细胞破碎后的上清液经过60 ℃的热处理后，纯化出了可用于工业应用的纤维素酶，极大地降低了下游处理成本。由于该酶的编码基因含有较多的稀有密码子，因此下一步考虑将其基因的稀有密码子进行定点突变成大肠杆菌的优势密码子，通过对表达质粒的TIR区域进行mRNA二级结构分析后，优化mRNA二级结构，以进一步提高其表达水平。

参考文献：

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3 小结与讨论

本研究采用了热激载体pHsh作为表达载体，将来源于热纤梭菌的内切β-1，4-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中成功表达。该表达载体是由大肠杆菌σ32因子调控，包括一个热激启动子和终止子，通过热激就可以高效地表达外源基因，所以在诱导外源基因表达过程中就不需要加入化学诱导剂。化学诱导剂如IPTG比较昂贵，是基因工程菌株在工业化应用中的一个瓶颈问题，而热激诱导能很好地降低了基因诱导表达成本，这无疑在工业化应用中具有巨大的优越性和现实意义[9，10]。本研究中利用热纤梭菌的纤维素酶耐热性，将重组菌细胞破碎后的上清液经过60 ℃的热处理后，纯化出了可用于工业应用的纤维素酶，极大地降低了下游处理成本。由于该酶的编码基因含有较多的稀有密码子，因此下一步考虑将其基因的稀有密码子进行定点突变成大肠杆菌的优势密码子，通过对表达质粒的TIR区域进行mRNA二级结构分析后，优化mRNA二级结构，以进一步提高其表达水平。

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