川牛膝多糖对口蹄疫疫苗受免小鼠树突状细胞成熟的影响

封海波，刘 娟，宋振辉，杜小刚，韩兴发，赵 冰

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌 402460；2.四川农业大学生命科学与理学院101实验室，四川 雅安 625014）

川牛膝为苋科植物川牛膝的干燥根，是一种著名的传统中药，主产于四川、云南、贵州等地，是一种川产道地药材，其味苦、酸，性平，入肝肾经，具有补肝肾，强筋骨，活血化瘀之功效[1]，据报道多糖类成分是川牛膝主要活性成分并具有免疫增强的功能，表现在：能促进鸡的体液免疫功能[2]，红细胞免疫功能[3]及免疫器官的生长发育。我们前期的试验也证明，川牛膝水提物能够增强小鼠对卵清白蛋白（OVA）和口蹄疫疫苗特异性免疫应答的水平[4]。

树突状细胞(DCs)为机体内的一种抗原提呈细胞，在诱导针对疫苗的免疫应答中发挥重要作用，其成熟和迁移是发挥作用的关键步骤。未成熟的DC在外周组织中摄取并处理入侵的抗原分子，之后开始向引流淋巴结迁移[5]，当到达引流淋巴结时，其已转变成为成熟的DC，具备将抗原提呈给初始T细胞的能力。研究发现，很多疫苗的佐剂均通过促进受免动物体内的树突状细胞的成熟途径来增强该疫苗的免疫效果[6]。共刺激信号分子（CD40，CD80，CD86）和MHC分子（MHCⅠ/Ⅱ类分子）是树突状细胞成熟的主要标志，而CXC型趋化因子受体4（CXCR7）和CC趋化因子受体（CCR7）则是其迁移的标志物[7]。

前期的试验已证明，RCPS具有一定的免疫增强作用，为进一步探讨其机理，本试验以小鼠为试验动物，将RCPS配合O型口蹄疫(FMD)疫苗免疫小鼠，通过测定受免小鼠树突状细胞中CD40，CD80，CD86表达水平及MHCⅠ、MHCⅡ、CXCR4、CCR7的mRNA表达水平，来观察RCPS对口蹄疫疫苗受免小鼠树突状细胞成熟的影响，为将RCPS开发成新型的免疫增强剂提供试验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 川牛膝多糖，采用超声辅助下水提醇沉法提取，经进一步纯化后，通过硫酸苯酚法测定含量，含量为78.9%。多糖使用前用去离子水稀释成所需要的浓度，常规高压灭菌后备用。荧光标记单克隆抗体：CD11c-FITC，CD40-PE，CD80-PE CD86-PE，购自Qbiogene(Southern California，USA)；反转录试剂盒PrimeScript®RT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)，宝生物工程（大连）有限公司；O型口蹄疫疫苗，中牧实业股份有限公司兰州生物药厂产品；莫能菌素、多聚甲醛和皂素，购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组及免疫 选取雌性ICR小鼠40只，4～6周龄，体重20～24 g，购自华西实验动物中心。将小鼠随机分为4组：FMDV组（疫苗对照组），FMDV+RCPS（25mg）组、FMDV+RCPS（50mg）组，FMDV+RCPS（100mg）组，每组10只小鼠。根据前期试验的结果确定本试验给药剂量，试验组小鼠每次免疫前1 d腹腔注射川牛膝多糖溶液1次，各组对应给药剂量分别为：0、25、50、100mg/kg体重，注射体积0.2mL/只，对照组注射同体积的生理盐水。每次免疫均通过腹股沟皮下注射FMD疫苗200μL，间隔14 d连续免疫2次。

1.2.2 检测共刺激信号分子表达水平 在二免后14 d处死小鼠，制备脾脏单细胞悬液，调整细胞浓度到2.5×106个/mL。细胞处理过程如下：用抗Fcγ-mAb封闭，通过浓度为4%多聚甲醛于4℃固定8min，经0.1%皂素破膜5min，用PBS洗两次，用10μL羊抗小鼠荧光单克隆抗体CD11c-FITC，CD40-PE，CD80-PE，CD86-PE，于4℃暗处染色30min，并设相应的同型对照。取300μL细胞悬液上流式细胞仪检测。

1.2.3 检测MHCⅠ，MHCⅡ，CXCR4，CCR7的mRNA表达水平 几种分子mRNA检测通过实时荧光定量PCR方法进行，首先通过苯酚-氯仿法提取总RNA，然后电泳检测5 sRNA、18 sRNA、28 sRNA以检测其完整性以及是否污染。所提取出来的RNA采用反转录试剂盒PrimeScript®RTreagentkitwith gDNA Eraser(PerfectReal Time)，将其反转录成cDNA，相关操作严格按照操作说明书进行。然后以cDNA为模板在特定引物下进行定量检测，每个样品跑3次重复，PCR程序为95℃10 s，然后进行40个循环的PCR：95℃变性5 s，58-61℃退火+延伸25 s，最后进行熔解曲线以监测PCR扩增产物的特异性。目的基因mRNA相对表达水平采用标准曲线法进行计算。待检测基因及基因检测所采用的引物序列见表1。

表1 本研究所用引物

1.3 统计学处理 试验结果用t-检验进行统计学分析，P＜0.05差异显著，P＜0.01差异极显著。

2 结果

2.1 RCPS对共刺激信号分子（CD40，CD80，CD86）表达水平的影响 受免小鼠树突状细胞中CD40表达水平结果如图1A所示：25mg的RCPS显著升高CD40表达水平（P＜0.05)，50、100mg的RCPS极显著提高了CD40的表达水平（P＜0.01)。CD80表达检测结果如图1B所示，3个剂量的RCPS均极显著提高了CD80的表达水平（P＜0.01)；CD86的检测结果如图1C所示25、50mg的RCPS显著上调了CD86的表达水平（P＜0.05)，100mg的RCPS极显著提高了CD86的表达水平（P＜0.01)。由此可知，3个剂量的RCPS均能很好的提高树突状细胞中共刺激信号分子（CD40、CD80、CD86）的表达水平。

2.2 脾细胞中MHCⅠ，MHCⅡ，CXCR4和CCR7的mRNA表达水平 二次免疫后14 d，采集脾脏，常规方法提取RNA，通过荧光定量PCR检测各组小鼠脾细胞中MHCⅠ和MHCⅡ的mRNA表达水平。结果如图2A所示，与对照组相比，RCPS（50mg、100mg）配合FMD疫苗免疫小鼠，极显著上调小鼠脾脏MHCⅠ、MHCⅡ类分子mRNA表达水平 (P＜0.01)，RCPS（25 mg）配合FMD疫苗免疫显著上调MHCⅠ、MHCⅡmRNA表达水平(P＜0.05)。

图1 RCPS对口蹄疫疫苗受免小鼠树突状细胞中CD40、CD80、CD86表达水平的影响

各组小鼠脾细胞中趋化因子受体CXCR4和CCR7的mRNA表达水平。结果如图2B所示，与对照组相比，RCPS（50mg、100mg）配合FMD疫苗免疫小鼠，极显著上调CXCR4和CCR7mRNA表达水平 (P＜0.01)，RCPS（25 mg）配合FMD疫苗免疫显著上调CCR7mRNA表达水平(P＜0.05)。

图2 RCPS对口蹄疫疫苗受免小鼠脾脏中MHCⅠ,MHCⅡ,CXCR4,CXCR4,CCR7mRNA表达水平的影响

3 分析与讨论

3.1 RCPS对主要组织相容性复合体（MHC I、MHC II）表达水平的影响 MHC分子中与抗原提呈相关的主要是MHCⅠ、MHCⅡ类分子，MHC分子最基本的功能是与抗原肽结合，其中MHC I类分子与内源性抗原肽结合，MHC II类分子与外源性抗原肽结合，以肽-MHC复合物（pMHC）形式表达在树突状细胞等抗原提呈细胞表面，被CD4+或CD8+T细胞识别后启动适应性免疫应答[8]。这两种分子的高水平表达也被认为是DCs成熟的标志性特征，树突状细胞成熟的过程则是其发挥抗原提呈功能的核心，故其在免疫应答尤其是适应性免疫应答中发挥重要作用。本研究中观察到RCPS与FMD疫苗配合使用后，可有效促进DC表面MHC I、MHC II分子mRNA的表达水平，由此可推测RCPS配合口蹄疫疫苗使用能够显著促进树突状细胞成熟提高抗原提呈效率，从而增强机体对疫苗的免疫应答。

3.2 RCPS对树突状细胞CD40、CD80、CD86表达水平的影响 树突状细胞将抗原肽提呈给初始T细胞的过程中即给T细胞提供了激活的第一信号，但是仅此信号不足以使T细胞活化，需要由第二信号的参与才可以完成对T细胞有效的刺激[7]。DC通过位于细胞表面的共刺激信号分子（CD40、CD80和CD86等）与T细胞表面的DC40L和CD28相互作用，为T细胞提供第二信号将其激活,从而引发机体内的一系列针对疫苗的免疫应答。本试验观察到与疫苗对照组相比，RCPS能显著促进CD40、CD80和CD86等共刺激信号分子的表达水平从而为激活T细胞提供更为充足的“第二信号”。

3.3 RCPS对树突状细胞趋化因子受体CXCR4、CCR7表达水平的影响 趋化因子对于免疫细胞迁移至关重要，在其结合趋化因子受体这种G蛋白偶联受体之后引起其构想变化从而引发胞内的信号通路最终实现细胞的运动或激活[9]。CXCR4和CCR7这两种趋化因子受体具有多种功能，能影响胸腺结构和功能，引导静息和调节性T细胞通过上皮静脉回归淋巴结以及在静息或炎症情况下引导DCs回归并停留在淋巴结。鉴于其对DCs的功能，本研究通过实时定量PCR检测了CXCR4和CCR7基因的表达水平，结果表明，RCPS可促进这两种趋化因子受体的基因表达，由此可推测RCPS可以促使DCs迁移至二级淋巴器官。在二级淋巴器官，DCs与T、B淋巴细胞作用发挥免疫功能。位于二级淋巴器官的DC已经成熟，因此CXCR4和CCR7 mRNA的高表达也间接反应了DCs的成熟程度。

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