中国牛种布鲁氏菌疫苗株A19SNP位点的研究

谭鹏飞，南文龙，彭大新，毛开荣，陈义平*

(1.中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛266032;2.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009;3.中国兽医药品监察所，北京100081)

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为主要特征的人畜共患传染病，严重威胁人和多种动物健康［1］。弱毒疫苗免疫是布病防控的重要手段，但其使用往往会干扰布病诊断和监测。

布鲁氏菌A19菌株于1923年由美国自牛奶中分离，经实验室自然传代减毒后，成为一株毒力稳定的弱毒菌株，是我国目前在用的布鲁氏菌疫苗株之一［1］。疫苗株S19是在A19基础上筛选出的赤藓糖醇敏感株。S19基因组较A19存在Ery基因缺失，OIE将这一特点作为S19的鉴别诊断依据，但该方法并不适用于A19。目前，A19鉴别检测研究尚少，本研究拟筛选、验证A19基因组的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，为疫苗株A19与野生菌株的鉴别提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 23种布鲁氏菌见表1。布鲁氏菌常见种及生物型标准株由中国兽医药品监察所保存，布鲁氏菌疫苗株 A19、S19、M5-90、S2、104M 由中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室保存。

表1 使用的布鲁氏菌株及登录号

1.1.2 主要试剂 dNTP、DL2000 Marker、EX TaqⓇHot Start DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司;蛋白酶K购自Sigma公司;胰蛋白胨培养基购自默克化工技术(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的培养及基因组DNA的提取 实验菌株复苏和培养参照中国兽医菌种目录中方法，细菌基因组DNA提取采用蛋白酶K法按常规步骤［2］进行。

1.2.2 SNP位点的分析筛选 从GenBank中下载与布鲁氏菌疫苗株A19同源的S19株全基因组序列(GenBank登录号:NC_010742.1、NC_010740.1)，利用生物信息学软件BLAST和DNAstar，将S19基因组逐段与 GenBank中 B.melitensis M28、B.suis S1330、B.pinnipedialisB2/94、B.microti CCM 4915、B.canis ATCC 23365、B.ovis ATCC 25840 等16株布鲁氏菌基因组序列进行比较，分析筛选S19全基因组序列SNP位点。

1.2.3 SNP位点的测序鉴定 以筛选出的SNP位点为依据，对含有SNP位点的相关基因设计引物(表2)，以A19基因组DNA为模板，进行PCR扩增，测序鉴定A19基因组SNP位点处的核苷酸序列。

反应体系 25 μL:10 ×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)2.0 μL、引物 (20 μmol/L)各 1.0 μL、EX TaqⓇHot Start(5 U/μL)0.3 μL、Template 2.0 μL、ddH2O 9.7 μL;反应程序:95℃预变性5 min;95℃ 40 s，52～60℃(退火温度根据引物Tm值确定)40 s，72℃40 s，35个循环;72℃ 延伸6 min。PCR反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果，PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.2.4 SNP位点的选择验证 选择2～3个经鉴定正确的A19 SNP位点，以布鲁氏菌常见种及生物型的标准株和疫苗株M5-90、S2、104M等共21株布鲁氏菌的基因组DNA模板(表1，编号1-21)，按1.2.3方法，对相关基因进行扩增，PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司测序。分析上述21株布鲁氏菌基因组在所选SNP位点处的核苷酸序列，验证所选SNP位点的A19特异性。

2 结果

2.1 SNP位点的分析筛选结果 将S19全基因组与GenBank中其他布鲁氏菌全基因组序列进行比较，分析获得29个SNP位点，碱基位置和变化见表3。

2.2 SNP位点测序鉴定结果 以A19基因组DNA为模板，对2.1中S19的29个SNP相关基因PCR扩增，均获得了与预期相符的目的条带(图1)。测序结果显示，A19这29个基因的序列与S19同源性为100%，说明A19基因组存在与S19基因组相同的29个SNP位点。

表2 SNP相关基因的PCR扩增引物

表3 S19基因组SNP位点所在基因碱基位置和变化

图1 SNP相关基因PCR扩增结果

2.3 SNP位点的验证结果 结果显示，仅A19与S19 基因组存在 ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503的突变，而布鲁氏菌常见种及生物型的标准株及疫苗株基因组相应位置均没有变化，说明上述3个SNP位点为A19(或S19)特异。

3 讨论

3.1 疫苗株A19的鉴别研究 布鲁氏菌疫苗的鉴别主要包括血清抗体和病原两方面。A19疫苗株为光滑型菌株，其LPS含有O-侧链，能刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，但也使常规血清学检测方法无法区分疫苗免疫与自然感染［1］。在A19病原鉴别方面，谷文喜等［3］发现VirB8基因上108位碱基的G-T突变，可作为疫苗株A19和544A与野生菌株的鉴别依据之一;吴冬玲等［4］利用A19赤藓醇代谢基因序列差异，区分了我国疫苗株A19和牛I型强毒株2308，但是上述两种方法还未能明确区分出疫苗株A19与野生菌株。钟旗等［5］建立了聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析方法，首先以AMOS-PCR方法区分牛种布鲁氏菌株，再以B1-PCR方法鉴定牛种生物I型菌株，然后以Ery-PCR方法对牛种生物I型菌株和A19株基因组DNA进行扩增，通过SSCP电泳根据条带数目和大小的差异，区分了牛种生物I型菌株和A19株，从而对疫苗株A19与野生菌株进行了鉴别。目前，我国布病防控工作中，尚缺少直接、快速的疫苗株A19分子鉴别检测方法。

3.2 疫苗株A19的SNP位点 SNP指单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形态。近年，SNP位点广泛的应用于细菌耐药性基因、细菌分种分型、病毒分型等鉴别检测中［6-8］。Gopaul等［9］利用S19基因组ClpX、LysR两个基因SNP位点的差异，通过荧光定量PCR实现了S19的分子鉴别检测。当前，我国尚未推广弱毒疫苗S19株，A19与S19基因组具有高度的同源性，S19基因组特异的SNP位点，若在A19含有相同SNP位点，同样适用于我国A19株的鉴别。

本研究以S19基因组为依据，经与GenBank中公布的布鲁氏菌全基因组比对，筛选了29个SNP位点，并证实A19基因组存在相同的SNP位点。选取ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503等3个SNP位点，通过与布鲁氏菌常见种及生物型的标准参考株和疫苗株M5-90、S2、104M等共21株布鲁氏菌的基因组SNP位点处的核苷酸序列比较，证明这3个SNP位点仅存在于A19(或S19)基因组上，而其他种、生物型布鲁氏菌或疫苗株上均没有发现相应突变，说明这3个SNP位点可用于我国布鲁氏菌疫苗株A19与野生菌株的鉴别。同时，也说明Gopaul等［9］建立的S19鉴别检测荧光定量PCR方法，目前同样适用于我国布鲁氏菌疫苗株A19的鉴别。

此外，笔者还对近年采集于我国布鲁氏菌非免疫地区的血清及奶样中提取的核酸样品进行了检测，其中经B4/B5-PCR方法［10］检测阳性的样品，经本方法检测均未发现上述3个基因SNP位点处存在突变，即样品为非疫苗株A19的野生菌株感染。

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［4］吴冬玲，钟 旗，谷文喜，等.3株牛布鲁氏菌19疫苗株赤藓醇代谢基因的克隆与序列分析［J］.新疆农业大学学报，2008，31(2):59-62.

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