针刺干预实验性脑出血大鼠细胞凋亡的时效研究

刘学文 周 竞 彭 平 张宏生 李 平 荆志伟

（1.首都医科大学潞河教学医院，北京 101100；2.北方工业大学医院，北京 100041；3.中国中医科学院望京医院，北京 100102；4.北京中医药大学，北京 100029；5.天津市第三中心医院，天津 300170；6.中国中医科学院，北京 100700）

脑出血是指原发性非外伤性脑实质内出血，是急性脑血管疾病中的危重类型，发病率、死亡率及致残率均较高，严重危害人类健康及生活质量［1］，目前神经内、外科治疗效果并不令人满意［2］，脑出血早期是治疗的关键［3］。中医药包括针灸疗法在脑出血急性期治疗中得到广泛应用，已成为整个治疗体系中重要的一部分［4-6］。但在脑出血发病后不同时期给予针刺疗效是否相同，针刺介入时机是否越早越好，是需要解决的问题。本研究通过观察不同时机介入针刺对细胞凋亡因子Bcl-2/Bax及HSP70的表达的影响，研究针刺治疗脑出血时机和疗效关系及其机理，以期为临床提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康Wistar大鼠（北京医科大学实验动物中心提供），体质量250～320 g，雄性。随机分为空白组、模型组及按针刺介入时间分为的3 h针刺组、9 h针刺组、24 h针刺组、48 h针刺组，每组10只。

1.2 仪器与试药 脑立体定向仪（日本SR-6N）；微量注射器（上海激光医学仪器厂）；涡轮牙钻机（北京自动化仪表三厂）；电子天平（日本ANDHR-120，精确度为0.1 mg）；恒温干燥箱（北京市朝阳区来广营医疗器械厂）；CMIS型细胞医学图像分析系统（重庆天海）；石蜡切片机 （德国LEICA RM 2135）；OLYMPUS光学显微镜（日本）；天平（常熟市衡器厂HR-120）；手术器械。

磷酸盐缓冲试剂（0.1 mol/L PBS 液，pH 7.2～7.4）：用氯化钠9g，12水磷酸氢二钠6 g，水磷酸二氢钠0.4g，加蒸馏水至1000 mL，调整pH到7.2～7.4。枸橼酸盐缓冲液（0.01 mol/L）：枸橼酸三钠 3 g，枸橼酸 0.4 g，加蒸馏水至1000 mL。防脱片剂：APES购自北京中山生物技术有限公司。甲苯、丙酮、无水乙醇、30%过氧乙酸，均为上海试剂一厂产品。苏木素、伊红为北京试剂三厂产品。即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒、一抗均为武汉博士德生物工程有限公司产品。TUNEL盒购于博海生物技术有限公司。

1.3 模型制备 以10%水合氯醛（300 mg/kg体质量）腹腔麻醉后俯卧位固定于立体定向仪上。固定大鼠时，先固定耳间线，待听到水平针穿破耳鼓膜的破裂声后，移头部至正中，接着固定门齿于门齿钩上，调整立体定向仪，使门齿钩平面比耳间线平面低2.4 mm，此时前后囟基本上在同一平面上。头部正中皮肤切开长约1 cm的纵切口，血管钳钝性分离暴露前囟，调整立体定向仪，使其上的微量注射仪套管尖端移至前囟后0.5 mm，左侧中线旁开3 mm，用微型电钻钻孔，穿透颅骨但不伤及脑组织。用40℃水温浴大鼠尾巴约10min后取出擦干，在距离大鼠尾巴末端约5 mm处剪断鼠尾，用微量注射仪吸取新鲜血液约50 μL，迅速插入已钻好的孔内，向内进针6 mm（相当于尾状核部位）。在2min内匀速注入10 μL血液，停针2min，再在2min内匀速注入40 μL血液，留置4min后，将针头提升2 mm，再留置8min，然后缓慢将微量注射器针头拔出，用医用骨蜡封闭骨孔。观察无出血后，缝合头部皮肤，加压包扎尾部切口。

1.4 神经功能缺损评价 术后1 h左右，造模大鼠清醒后即开始进行大鼠神经功能缺损评价，根据Bederson神经体征评分法［7］进行分级。轻抓鼠尾，提起高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直。0级（0分）：无神经功能缺损。1级（1分）：血肿对侧前肢回收屈曲于腹下，同侧前肢向地面伸展。2级（2分）：1级体征加俯卧于桌面时从血肿侧向对侧推大鼠时阻力降低。3级（3分）：1级体征加2级体征加大鼠行走向血肿对侧肢体旋转 （呈追尾状）。4级（4分）：意识丧失不能行走。

1.5 针刺穴位与方法 大鼠腧穴定位根据《动物针灸穴位图谱》，针刺组选取内关、人中针刺，内关用捻转泻法1min，人中用雀啄手法10次。各针刺组分别于造模成功后相应时间开始针刺，3 h针刺组在造模成功后3 h开始介入针刺，9 h针刺组在造模成功后9 h开始介入针刺，24 h针刺组在造模成功后24 h开始介入针刺，48 h针刺组在造模成功后48 h开始介入针刺，均每日针刺2次，连续针刺3 d。

1.6 标本采集与检测 模型组与针刺组均于造模成功后5 d处死，用断头器将大鼠断头处死，小心剥离颅骨，取出完整脑组织，以左侧大脑半球中部注射针眼处为中点，冠状位切割脑组织，层厚约2 mm，用于免疫组化，在注射针眼处后4 mm的层厚约1 mm的组织用于脑含水量测定。将应用免疫组化方法的组织固定在4%多聚甲醛中24 h，标本依次梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，在石蜡切片机上连续切片，片厚5 μm，相邻切片分别作免疫组化和TUNEL染色，相关方法按照试剂盒说明。

1.7 判断标准 （1）免疫组化结果判断标准。以细胞胞浆或细胞核出现黄色颗粒为阳性，对每张玻片取5个高倍视野，计数5个高倍视野内阳性细胞总数，然后计算每个高倍视野下阳性细胞的均数。（2）TUNEL染色结果判断标准。高倍镜下可见TUNEL阳性细胞大部分为核呈棕黄色或棕褐色，标记细胞核有明显固缩、碎裂，少量为弥漫性淡染的核。前者是要计数的凋亡细胞。每张切片光镜下（×400）分别随机计算5个视野的阳性细胞数，以平均值代表计数结果。

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。各项检测结果以（）记录，两组间比较用t检验，多组间用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组动物Bcl-2在血肿周围的表达情况 见表1。各针刺组分别与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；3 h针刺组与9 h针刺组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各针刺组之间相比差异有统计学意义（P＜0.01或0.05）。正常组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白的表达水平较低，仅见少数该细胞胞浆着色；模型组大鼠脑血肿周围脑组织表达水平明显增高，胞浆着色且着色较深。针刺组各组血肿周围也有不同程度的表达，按表达水平从高到低依次为3 h针刺组、9 h针刺组、24 h针刺组、48 h针刺组。

表1 各组Bcl-2表达水平比较（）

表1 各组Bcl-2表达水平比较（）

与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与 3 h 针刺组比较，**P＜0.05；与9 h 针刺组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；与 24 h 针刺组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01。下同。

2.2 各组动物Bax在血肿周围的表达情况 见表2。各针刺组分别与模型组相比差异有统计学意义 （P＜0.05或0.01）；3 h针刺组与9 h针刺组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各针刺组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。正常组大鼠脑组织中Bax蛋白的表达水平较低，仅见少数该细胞胞浆着色；模型组大鼠脑血肿周围脑组织表达水平明显增高，胞浆着色且着色较深。针刺组各组血肿周围也有不同程度的表达，按表达水平从低到高依次为3 h针刺组、9 h针刺组、24 h针刺组、48 h针刺组。

表2 各组Bax表达水平比较（）

表2 各组Bax表达水平比较（）

组 别 n空白组 10模型组 103 h针刺组 10阳性细胞数4.27±1.3123.03±2.8115.33±1.94△△9 h 针刺组 10 15.96±1.84△△24 h 针刺组 10 18.21±1.84△△**☆48 h 针刺组 10 20.58±2.46△**☆☆●

2.3 各组动物HSP70在血肿周围的表达情况 见表3。各针刺组分别与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；3 h针刺组与9 h针刺组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各针刺组之间相比差异有统计学意义（P＜0.01）。正常组大鼠脑组织中HSP70蛋白的表达水平较低，仅见少数该细胞胞浆着色；模型组大鼠脑血肿周围脑组织表达水平明显增高，胞浆着色且着色较深。针刺组各组血肿周围也有不同程度的表达，按表达水平从高到低依次为3 h针刺组、9 h针刺组、24 h针刺组、48 h针刺组。

2.4 各组动物凋亡细胞在血肿周围的表达情况 见表4。各针刺组分别与模型组差异有统计学意义 （P＜0.01）；3 h针刺组与9 h针刺组差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各针刺组之间差异有统计学意义（P＜0.01或0.05）。正常组大鼠脑组织中各视野偶见TUNEL阳性细胞。模型组大鼠脑血肿周围脑组织表达水平明显增高，胞浆着色且着色较深。针刺组各组血肿周围脑组织也有不同程度的表达，按表达水平从低到高依次为3 h针刺组、9 h针刺组、24 h针刺组、48 h针刺组。

表3 各组HSP70表达水平比较（）

表3 各组HSP70表达水平比较（）

表4 各组凋亡细胞表达水平比较（）

表4 各组凋亡细胞表达水平比较（）

3 讨 论

本研究采用立体定向技术向大鼠左侧脑基底节注入自体定量不凝血制作脑出血模型［8］。基底节是大鼠脑内最大的核团，易于立体定向，也是人类脑出血好发部位。注入自体不凝血50μL，相当于人类脑出血40mL，为临床最多见出血量。本研究采用两次注血两次退针法，可有效地避免自体血从穿刺针孔处溢出及脑室反流。

脑出血后多种因素导致细胞凋亡，细胞凋亡参与脑出血后某些神经细胞损伤［9-12］，典型的凋亡细胞在形态学上表现为最终形成由细胞膜包裹、含有多少不等核碎片及细胞质的小体，称之为凋亡小体（apoptosis body），吞噬细胞快速吞噬凋亡小体。大鼠自体血脑出血后血肿周围脑组织有Bcl-2/Bax、HSP70表达及细胞凋亡，Bcl-2/Bax和HSP70在脑出血后神经细胞凋亡过程中起重要调控作用。Bcl-2是一种凋亡抑制基因，Bax是一种促抑制基因，通过作用于线粒体而诱导细胞凋亡的发生，Bcl-2过度表达可有效地抑制神经元凋亡，但Bax的作用却相反，且将死的神经元Bax表达增加，Bcl-2则减少，故Bcl-2/Bax的比率可能决定神经元存亡［13-16］。HSP70是一种应激保护蛋白，可通过抑制细胞因子炎症反应，抑制凋亡激活基因Bax表达，与抑凋亡基因Bcl-2协同作用，保护线粒体功能等发挥抑制凋亡的的作用［17-20］。

中医的预防医学概念主要包括两方面：未病先防，既病防变。任何疾病都有一定的传变规律和发展趋势，中医十分重视掌握病能病势，主张在疾病未发生或刚发生时就及时截断其恶性发展的趋势［21-22］。脑损伤后中枢神经系统在结构上和功能上能够进行重组和代偿，部分神经可以再生，这是大脑可塑性的生理、生化或形态学改变的基础［23-24］。针刺可加速脑组织的侧支循环建立，促进病灶周围组织或健侧脑细胞的重组或代偿，更大地发挥脑的可塑性［25-26］。细胞凋亡是脑出血血肿周边脑组织损伤的主要病理生理机制之一，主要发生在血肿周围的缺血半暗带区。在脑出血早期及时有效地治疗血肿周围的半暗带区，可抑制细胞凋亡，提高神经功能的恢复程度。否则，当细胞损害进入不可逆阶段，即病理损害过程已形成后，就失去了治疗的最佳时机。

总之，本研究表明，从出血后3 h到出血后48 h各时间点介入针刺，均可抑制脑组织的细胞凋亡，但介入时间越早，对促凋亡因子Bax阳性表达细胞数降低越显著，对抑凋亡因子Bcl-2及HSP70阳性表达细胞数增加越显著，对脑组织病理变化改善越明显，提示干预时机越早，细胞凋亡损伤越小。针刺治疗脑出血大鼠脑组织损伤，介入时间越早效果越好，在出血后3～9 h进行针刺干预是最佳时机，48 h内治疗仍有意义，可通过抑制细胞凋亡减轻脑组织的继发性损伤。

［1］吴江，贾建平，崔丽英.神经病学［M］.2版.北京：人民卫生出版社出版社，2012：170.

［2］杜伟，范存刚，张庆俊.解读2010年美国心脏协会/美国中风协会《自发性脑出血诊疗指南》［J］.中华神经外科杂志，2011，27（10）：1074-1076.

［3］彭斌.脑出血的治疗进展［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2012，19（3）：164-166.

［4］廖远生，吴成翰，高丽丽.脑出血的中医药治疗进展［J］.国际中医中药杂志，2012，34（1）：83-85.

［5］张树泉，刘强.脑出血中医治疗研究进展［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2013，11（5）：605-607.

［6］张晓忠，邹伟，王威岩.针刺治疗脑出血急性期作用机制的研究进展［J］.针灸临床杂志，2011，27（5）：73-74.

［7］Bederson JB，Pitts LH，Nishimura MC，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17：472-476.

［8］Kaufan HH，Pruessner JL.A rabit model of intracerbral hematoma［J］.Acta Neuropathol，1985，65（3-4）：318-321.

［9］Timmer JC，Salvesen GS.Caspase substrates［J］.Cell Death Differ，2007，14（1）：66-72.

［10］Hu YY，Dong XQ，Yu WH，et al.Change in plasma S100B level after acute spontaneous basal ganglia hemorrhage ［J］.Shock，2010，33（2）：134-140.

［11］Wang WH，Yu WH，Dong XQ，et al.Plasma adiponectin as an independent predictor of early death after acute intracerebral hemorrhage［J］.ClinChimActa，2011，412（17/18）：1626-1631.

［12］Xi G，Keep RF，Hoff yr.Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage［J］.Lancet Neurol，2006，5（1）：53-63.

［13］吴岚，刘开祥，俸军林，等.三七总皂苷对脑出血大鼠细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响［J］.中国中医急症，2012，21（10）：1591-1592.

［14］刘天丹，黄良国，王风英，等.刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响［J］.中国老年学杂志，2010，30（10）：2788-2791.

［15］魏秀娥，荣良群.实验性大鼠脑出血脑内Bax、Bcl-2表达的实验研究［J］.中国实用神经疾病杂志，2010，13（24）：1-3.

［16］杨琴芳，许毅，秦峰.桃核承气汤对大鼠脑出血急性期Bcl-2、Bax蛋白表达的影响［J］.南京中医药大学学报，2009，25（4）：281-282.

［17］康雷，何泽云，黄仁发，等.天生饮对肾血管性高血压大鼠急性脑出血 TNF-α、HSP70表达影响的实验研究［J］.中国中医基础医学杂志，2008，14（5）：376-379.

［18］蒋国红，黄良国，施迎兵.IL-10对脑出血大鼠HSP70、caspase-3 表达的影响［J］.重庆医学，2012，41（19）：1948-1950.

［19］彭建伟，许予明，张松坡.脑室出血大鼠不同部位脑组织热休克蛋白 70 表达的差异［J］.中国卒中杂志，2010，5（5）：374-378.

［20］宋友，程鸿斌，陆晓红.大鼠脑出血灶周HIF-1α、HSP70表达及GM1对其变化的影响［J］.中国现代药物应用，2008，16（2）：1-3.

［21］刘红樱，王蔚.“治未病”中医理论在动脉粥样硬化防治中的应用［J］.现代中西医结合杂志，2012，21（7）：745-746.

［22］林嬿钊.亚健康与中医 “治未病”［J］.广东医学，2012，33（1）：8-9.

［23］谢鸿宇，吴毅.丰富环境对脑损伤后神经再生影响的研究进展［J］.中华物理医学与康复杂志，2011，33（5）：389-391.

［24］胡宝英，姜正林，李霞，等.人参总皂苷对创伤性脑损伤大鼠大脑皮质神经再生相关因子表达的影响［J］.中华神经外科杂志，2012，28（8）：848-852.

［25］张毅敏，唐纯志，程少冰，等.针刺对创伤性脑损伤犬鼠脑组织EGF和bFGF表达的影响 ［J］.中国病理生理杂志，2012，28（6）：1132-1134.

［26］陈杰奎，刘振寰.针刺促进大脑神经发育与修复的新进展［J］.中医儿科杂志，2011，7（1）：56-59.