α-突触核蛋白寡聚体抑制大鼠原代培养神经元突起早期生长

王 鹏 李 昕 陈予东 杨巍巍 李旭冉 于 顺*

(1.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室，北京100053;2北华大学基础医学院人体解剖学教研室，吉林吉林132013)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是临床上最常见的神经系统退行性疾病之一，表现呈进展性，目前临床上尚无控制病程发展的有效措施，因此揭示这一疾病的机制，采取早期诊断并预防显得日益迫切。PD的病理特征为黑质多巴胺能神经元发生变性坏死，以及路易小体(Lewy body)和路易轴索(Lewy neurite)的形成［1-2］。Lewy body和Lewy neurite是纤维淀粉样变的嗜酸性包涵体。人α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是参与形成淀粉样变性的主要成分。已知，LB的主要成分是聚集的α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)［3-6］，聚集成寡聚体的 α-Syn对神经元具有毒性作用［7-8］。α-Syn 主要分布于突触前膜和核膜［9-11］，与细胞的信号转导有关，参与突触形成、维持和神经元的分化。近来研究［12］表明α-Syn与微管蛋白互为分子伴侣，通过促进微管蛋白的聚合，α-Syn能够加速微管的形成。本课题组进一步发现α-Syn可以促进原代培养的大鼠原代神经元和MES23.5细胞的突起生长［13］，该功能片段位于蛋白的NAC段和C端，其家族型突变体A53T、A30P没有突起促生长功能［14］。这些发现提示α-Syn的突起促生长功能改变及其潜在的对突触可塑性影响可能是PD发病早期的重要线索。本研究的目的是探讨α-Syn的寡聚体对神经元突起生长的影响，为揭示PD发病中Lewy小体形成及其发病机制提供线索。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

BCA蛋白质定量试剂盒，购自Pierce Biotech公司;α-Syn单克隆抗体3D5，由首都医科大学宣武医院神经生物研究室制备;FITC标记的羊抗鼠抗体，购自中衫金桥公司;细胞培养基neurobasal和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;蛋白相对分子质量标准，购自美国Pharmacia公司。其他均为化学分析纯试剂。

1.2 实验动物

新生24 h Wistar大鼠32只，雌雄不限，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心［实验动物许可证号:SCXK-(军)2002-001］。

1.3 实验方法

1.3.1 α-Syn重组蛋白的制备与纯化

将人α-Syn cDNA分别插入表达载体pET(3a)，然后转化至BL21(DE3)感受态细胞，在含氨苄西林的YTA培养液中培养，以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导重组蛋白表达。所表达的基因重组型蛋白采用离子交换层析和反向层析法纯化。将纯化后的蛋白透析，分装，冷冻抽干。纯化后的蛋白用SDS-PAGE法和Western blotting法鉴定，BCA法定量。

1.3.2 α-Syn寡聚体标准品的制备

将α-Syn冻干粉末用PBS溶解使其终质量浓度为100 μmol/L，经0.22 μm 滤膜过滤除菌，在37 ℃下650 r/min恒温振荡72 h。

1.3.3 α-Syn寡聚体的测定

参照作者实验室已建立的方法［15］进行测试。用浓度为1 mg/L 3D5包被96孔酶标板，2.5% 明胶封闭2 h。加入寡聚体样品，37℃孵育2 h，再加入终浓度为1 mg/L生物素标记3D5抗体，37℃孵育2 h。洗板后向各孔加入1/5 000稀释的碱性磷酸酶标记的亲和素，37℃孵育后以对硝基酚磷酸(Disodium 4-nitrophenyl phosphate，pNPP)显色液显色，于波长405 nm处测定吸光度值。

1.3.4 原代神经元培养

将新生24 h大鼠断头取脑，置于D-Hank's缓冲液。剥去血管脑膜，分离皮质，剪碎。胰酶消化30 min后吹散，200目筛网过滤。800 r/min离心2 min。弃上清，沉淀以DMEM培养基悬浮并计数细胞。以0.75×105个/皿接种在用多聚赖氨酸包被好的培养皿(φ35 mm)中，加入相应蛋白进行分组培养。

1.3.5 神经元突起生长观察和长度测量

培养至第1、2和4小时，以多聚甲醛室温下固定1 h。随机挑选20个视野进行观察，每个视野至少有5个存活的神经元［16］。应用Image-Pro Plus V2.0软件测量神经元突起的长度。

1.3.6 Western blotting法和免疫荧光法鉴定转入细胞内α-Syn寡聚体

吸弃培养基，PBS冲洗。刮下细胞，超声破碎。功率200 W，30 s 2次，间歇30 s。破碎后的细胞溶液加入SDS-PAGE Running Buffer，沸水中煮5 min。离心并转移上清，取30 μL作为样品，进行SDS-PAGE。电泳结束后转PVDF膜、封闭。冲洗后，以1/1 000比例稀释的3D5抗体反应过夜。洗膜，再与1/5 000稀释的生物素标记的羊抗鼠抗体溶液反应。ECL法显示条带。

将培养细胞，以1%的戊二醛室温下固定1 h后，PBS冲洗培养皿。以含10%羊血清的PBST溶液，室温封闭1 h。弃封闭液，加入1/5 000稀释的3D5抗体1.5 mL，4℃过夜。PBST冲洗后加入1/500稀释的FITC标记羊抗鼠抗体，37℃，2 h;吸弃反应液，PBST冲洗。荧光显微镜下观察照相。

1.3.7 培养分组方案

向原代神经元培养基中添加终浓度为10 μmol/L的α-Syn寡聚体，培养至第1、2、4小时观察。分别添加终浓度为 1、5、10、15 和 20 μmol/L 的相应蛋白，培养至4 h，观察突起长度变化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件，数据均进行正态性检验，以均数±标准差(±s)表示。两组间比较采用t检验。多组样本均数比较采用析因方差分析法。两变量的相关分析采用Bivariate过程的Pearson直线相关法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组蛋白纯化鉴定结果

经SDS-PAGE和Western blotting法鉴定，获取的α-Syn和寡聚体纯度较高，根据分子量判断图1。

2.2 α-Syn寡聚体对神经元突起生长有抑制作用

添加α-Syn寡聚体(10 μmol/L)以及其他蛋白进行分组培养。经观察，在神经细胞生长早期，各组间细胞的形态和数量并无差异。细胞培养至1、2 h，添加α-Syn寡聚体组的神经元突起平均长度小于对照组(P＜0.05)。培养至4 h，α-Syn寡聚体组神经元突起长度明显小于对照组(P＜0.01)，详见图2。添加不同浓度(1～20 μmol/L)的各蛋白，培养至4 h观察，α-Syn寡聚体组突起长度随寡聚体浓度的增加而生长的趋势减小，对照组则无变化，详见图3。可见α-Syn寡聚体可以抑制神经元突起生长。

图1 α-Syn的纯化及鉴定Fig.1 Puritication and identification of α-Syn

图2 α-Syn寡聚体对神经元突起早期生长的影响Fig.2 The α-Syn oligomer inhibits on the neurite outgrowth

图3 α-Syn寡聚体对神经元突起生长的抑制作用具有剂量效应关系Fig 3.The effect of α-Syn oligomer inhibit on the neurite outgrowth appeared dose-effect dependent relation

2.3 α-Syn寡聚体可以从培养基进入神经元内

添加α-Syn寡聚体组神经细胞裂解液Western blotting法检测结果现清晰条带，对照组为阴性，图4A。免疫荧光实验结果显示神经元显色清晰，在胞浆内广泛分布并呈现颗粒状，α-Syn组在胞质内均匀分布，而对照组为阴性，见图4B。可见α-Syn寡聚体可以从培养基进入神经元并影响突起生长。

3 讨论

图4 α-Syn寡聚体向细胞内的转运Fig.4 Transportation of α-Syn oligomer into primarily cultured neurons

在原代神经元生长初期，微管(microtubule)在神经细胞的突起中起细胞骨架的作用，辅助突起发育。在成熟的神经元中，微管是物质运输的途径，参与神经递质的传递。体外研究［17］证明，α-Syn具有与tau蛋白相似的作用，可以促进微管蛋白组装成微管。本课题组前期研究［18-20］发现通过促进微管的组装，α-Syn可以促进大鼠原代神经元突起的生长，这一作用提示该蛋白很可能参与神经系统早期发育阶段神经元突起的形成以及中枢神经系统损伤后的修复。而在帕金森病的发病过程中，α-Syn异常聚集形成寡聚体。患者血液、脑脊液中亦可检测到主要成分为聚集的α-Syn的Lewy小体，由此可知致PD患者神经元死亡的内环境紊乱可能是由于α-Syn寡聚体的存在。本实验结果证实α-Syn的寡聚体可以进入原代神经元细胞内，并抑制突起的早期生长。这一结果的原因可能由于伴侣蛋白的异常聚集或寡聚体的直接干扰，影响微管的合成和有序排列，致使神经元突起修复和重建障碍或轴浆转运紊乱，导致细胞间或细胞内无定形物的形成聚集。促微管聚合的作用的丧失，可能影响神经系统的早期发育以及中枢神经系统损伤后的修复，对揭示α-Syn突变导致神经元退变的机制也有重要意义。

本研究结果显示，在原代神经元培养早期，外源性的α-Syn寡聚体可抑制突起生长。Sung等［21］实验发现α-Syn抑制H19-7大鼠海马神经祖细胞的增生。Western blotting法检测结果显示添加α-Syn寡聚体组细胞内蛋白免疫反应呈阳性，进入细胞的寡聚体以二聚体和三聚体为主，对照组为阴性。免疫荧光印迹结果显示，α-Syn组和寡聚体组在神经元内呈现轮廓清晰的绿色荧光，证明外源性的α-Syn和寡聚体在胞体和突起均有分布。外源性α-Syn进入神经元内，分布均匀。这与微管在细胞内的分布一致，提示进入细胞的α-Syn与微管蛋白之间存在伴侣关系。而寡聚体则呈现颗粒状分布，可能与其抑制微管蛋白聚合形成微管这一作用有关［22］。虽然α-Syn寡聚体的细胞毒性已作为PD研究的热点多时，但寡聚体的形成原因与机制仍未完全明确。本研究从α-Syn寡聚体与微管蛋白之间的共同作用关系入手，成为解释PD病因的新的观点。此研究结果为揭示α-Syn的功能，及其与微管蛋白的关系提供了新证据，对PD的病因、病机阐述提供了新思路。

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