寡聚化α-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴消化道中的表达

李 昕 杨巍巍 李旭冉 于 顺*

(1.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室教育部神经变性病重点实验室，北京100053;2.北京市老年病医疗研究中心分子诊断实验室，北京100053)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是临床上常见的神经系统退行性疾病之一。早期表现为非运动症状(non-motor symptoms，NMS)可达数年，如嗅觉障碍、胃肠功能紊乱、便秘、睡眠紊乱等。晚期PD特征性病理改变为中脑黑质多巴胺能神经元选择性、进行性丢失，残存神经元中有路易体(Lewy body)，其主要成分为聚集的 α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)。文献［1-3］报道，PD病程进展有可能是由于α-Syn由胃肠道神经丛扩散到相联的神经系统，累及延髓之后，伴随损伤神经元数量的增加而出现临床症状。α-Syn参与神经元生长、重塑、变性，其磷酸化修饰及寡聚化形成可促进神经元变性［4］。α-Syn单体形成在正常发育的神经元核及突触表达，目前认为其寡聚化修饰后有毒性［5］。本研究以灵长类动物食蟹猴为模型，应用Western blotting法及 ELISA方法证实 oligo-α-Syn和α-Syn在消化道不同部位中的表达，观察oligo-α-Syn和α-Syn在不同部位的表达差异以及与年龄的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

健康食蟹猴(4～16岁)9只，购自广西雄森灵长动物养殖中心，实验动物许可证号:SYXK(桂)2009-0006，所有动物均有详细出生档案和检疫证书，动物研究方案经动物福利委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)认证批准。青年猴3只(4岁)，中年猴3只(10～11岁)，老年猴3只(15～16岁)。兔抗人磷酸化α-Syn多克隆抗体(Santa cruz公司，美国);鼠抗人α-Syn单克隆抗体3D5由本室制备;HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉公司)，生物塑化的鼠单克隆抗体(康为世纪标记公司);4-硝基磷酸二钠盐(pNPP)(Sigma公司，美国);ELISA 96孔酶标板(Corning公司，美国);酶标仪(Tecan公司，瑞士);其他试剂为分析纯。

1.2 方法

1)消化道中寡聚化α-Syn的ELISA检测:用质量浓度为1×10-3g/L的3D5单抗包被96孔酶标板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，4 ℃过夜，PBST 洗板。10%BSA封闭，200 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST 洗板。加入倍比稀释的重组人 α-Syn(0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.125 mol/L、0.006 25 mol/L、0.031 25 mol/L、0 mol/L)和待测样品，100 μL/孔，37 ℃孵育 2 h，PBST 洗板，然后加入生物素化的3D5(1(10-3g/L)100 μL/孔，37℃孵育2 h，PBST洗板，再加入亲和素标记的碱性磷酸酶(1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗板，最后加入 pNPP，100 μL/孔，37 ℃显色 30 min，405 nm 处测定吸光度值。每次每个样品重复3孔，重复3次。

2)不同年龄段食蟹猴消化道蛋白样品制备:抽提青、中、老年食蟹猴消化道不同部位的全细胞蛋白组分，BCA法蛋白定量，-20℃保存备用。

3)α-Syn寡聚体的免疫印迹分析:分别取20 μg各组蛋白样品用10%SDS-PAGE分离后，半干法转移至PVDF膜。将PVDF膜与3D5单抗(1∶5 000)室温孵育2 h，然后与辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(1∶5 000)室温孵育1 h。ECL法检测辣根过氧化物酶活性。

1.3 统计学方法

应用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较使用单因素方差分析法和均数两两比较LSD方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测寡聚体α-Syn的ELISA标准曲线的建立

本研究建立的检测寡聚化α-Syn的ELISA方法，可以较特异地识别样本中的α-Syn寡聚体，而在含有单体α-Syn溶液中，仅能检测到极低的信号，详见图1。根据α-Syn的起始浓度，计算出本方法的最低检测限为～48 ng/孔。

图1 ELISA特异识别人α-Syn寡聚体Fig.1 ELISA method to recognize only the oligomeric species of human α-Syn

2.2 寡聚化α-Syn在不同年龄段猴消化道中的表达差异

ELISA结果显示，在老年食蟹猴的食管、胃底、十二指肠、空肠、回肠和结肠中，寡聚化α-Syn质量浓度较青年与中年猴显著增加，且差异有统计学意义(P＜0.01)。其中，在胃底、空肠和回肠中，寡聚化α-Syn随老化增加，呈年龄依赖性，详见图2。

2.3 α-Syn寡聚体在不同年龄段猴消化道中的Western blotting分析

抽提青年、中年、老年3组猴食管、胃底、回肠和结肠全细胞蛋白进行免疫印迹分析。在老年食蟹猴的食管、胃底、回肠和结肠中，寡聚化α-Syn质量浓度较青年与中年猴显著增加。其中，在胃底和回肠中，寡聚化α-Syn随老化增加，呈年龄依赖性，详见图3。

3 讨论

利用本室制备的α-Syn单克隆抗体(3D5)同时作为捕获抗体与检测抗体，笔者建立了可以检测寡聚化α-Syn的ELISA方法。本研究利用α-Syn寡聚体与单体标准品检测此法的敏感度及特异度，发现其只能检测寡聚化α-Syn，并且吸光度值与寡聚化α-Syn浓度呈线性关系，而对于单体形式的α-Syn不识别，提示此法有较高的特异度。本实验利用上述ELISA方法检测青(4岁)、中(10～11岁)、老(15～16岁)3个年龄组食蟹猴。以食蟹猴的年龄梯度作为自然老化的模型，研究α-Syn寡聚化在消化道不同部位肌间神经丛表达量与年龄的关系。

图2 寡聚化α-Syn在食蟹猴消化道中的表达Fig.2 Expression of oligo-α-Syn in digestive tract of cynomolgus monkeys

图3 寡聚化α-Syn在食蟹猴消化道中的Western blotting分析Fig.3 Western blotting for oligo-α-Syn in digestive tract of cynomolgus monkeys

笔者发现在老年食蟹猴的食管、胃底、十二指肠、空肠、回肠和结肠中，寡聚化α-Syn质量浓度较青年与中年猴显著增加，且差异有统计学意义(P＜0.01)。其中，在胃底、空肠和回肠中，寡聚化α-Syn随老化增加，呈年龄依赖性。同在食蟹猴结肠中发现的结果类似，但是老龄化食蟹猴更易于α-Syn聚集的原因尚不明确。α-Syn的翻译后修饰可能是原因之一:特殊的激酶如PLK使α-Syn磷酸化、硝基化反应，最终使α-Syn沉积形成路易包涵小体［6-8］。α-Syn经过磷酸化、硝基化的翻译后修饰，形成有毒性的不可溶聚合体，最终导致神经系统的功能障碍和神经元的崩解死亡［6，9-10］。此外，老龄化所致内环境改变也可能是促使α-Syn聚集的重要原因。已有研究［6］表明消化道及血浆［1］中α-Syn随年龄增加而增加，提示自然老化带来的α-Syn含量增高，提高了激酶的表达和氧化应激的环境，促进了磷酸化、硝基化的修饰反应，最终在老年猴结肠组织的肌间神经丛中高表达了寡聚化α-Syn。有研究［11-13］指出α-Syn和n-Syn的高表达与自然老龄化导致的α-Syn寡聚体蓄积增加有密切的关系。

本实验证实了自然老化对α-Syn的寡聚体有正向关系，可增加具有毒性的 oligo-α-Syn聚合物的表达，但具体的机制需要进一步的研究。本实验对α-Syn在PD病理进程中可能从外周神经系统开始的学说［14-15］进行了一定程度的验证，需继续结合PD敏感脑区做深入的机制研究。在日趋老龄化的现代社会，本实验的研究结果对PD典型临床症状未出现的早期诊断提供了一定的指导意义，可以应用结肠镜检查技术和规范统一的免疫组化技术，对老龄高发人群行临床前普查，提高早期诊断率。

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