α-突触核蛋白促进原代神经元及转基因小鼠神经细胞表面NMDA受体的内在化

陈予东 杨巍巍 李 昕 王 鹏 李旭冉 于 顺

(首都医科大学宣武医院神经生物学研究室北京市老年病医疗研究中心分子诊断实验室教育部神经变性病重点实验室，北京100053)

α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是一种由 144个氨基酸构成的酸性可溶性蛋白，主要存在于神经元突触前末梢［1］。α-Syn与神经退行性病变密切相关，在帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies，DLB)患者脑组织的路易体中(Lewy body，LB)［2-4］，肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者细胞内包涵体中［5-7］均能检测到α-Syn存在。但是α-Syn如何参与这些神经退行性病变的病理生理过程目前尚不明确。

α-Syn可分泌到细胞外［8］，而胞外 α-Syn可通过内吞相关蛋白-Rab5B［9］的介导快速进入细胞。鉴于Rab5B也参与N-甲基D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体的内在化，且文献［10-11］表明 α-Syn在多巴胺能神经细胞中促进NMDA受体内在化，因此本研究目的是在原代神经元及转基因动物水平上，观察α-Syn对NMDA受体的影响及相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料

健康C57/B6新生鼠，鼠龄0～12 h，野生型C57/B6鼠，18～22 g，由中国军事医学科学院动物中心提供(实验动物许可证号:SCXK-2014-004)。转α-Syn C57/B6小鼠，体质量18～22 g，由中国医学科学院动物中心提供(实验动物许可证号:SYXK:2014-0039)。杜恩斯组织匀浆器 (Wheaton Kimble公司，美国)。NMDA(Sigma公司，美国)，Neurobasal培养基 (Gibco公司，美国)，B27(Gibco公司，美国)，DMEM培养基(Gibco公司，美国)，胎牛血清(FCS)(Berlin公司，美国)，NMDAR NR1抗体 (Abcam 公司，英国)，DAPI(Sigma公司，美国)，Rab5B抗体 (Santa Cruz公司，美国)，Rab5B反义寡核苷酸 (百维恩公司，中国)，BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce Biotech公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 重组人α-Syn的制备

将人α-Syn cDNA插入表达载体pET。然后将pET-α-Syn转化至BL21(DE3)感受态细胞，在含氨苄西林的2%YTA培养液中培养，加IPTG诱导基因重组蛋白表达。所表达的基因重组型α-Syn采用离子交换层析和反向层析法纯化。BCA法定量纯化后的α-Syn。

1.2.2 海马神经元原代培养

冰上断头取出C57/B6新生鼠双侧海马，剪碎后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，用DMEM培养基(90%DMEM+10%胎牛血清)终止消化。玻璃滴管火焰抛光后，轻柔吹打。用DMEM培养基稀释成5×105/mm3的密度接种到直径35 mm多聚赖氨酸包被的培养皿，置于37℃，5%CO2的培养箱内。2 h后，显微镜下观察神经元贴壁后，改用Neurobasal、B27无血清培养基继续培养箱内培养。以后每3 d换液一次，培养10～12 d左右用于实验。

1.2.3 Rab5B反义寡核苷酸

Rab5B反义寡核苷酸(antisense sequence，AS)及扰乱顺序的寡核苷酸(scrambled sequence，SS)包被的慢病毒且携带GFP蛋白由中国百维恩公司采购，其序列分别为:5'-GCTGTGCTTCTGCTAGTCAT-3'和 5'-GGGTTCGTTTCTC-TCAGTCA-3'。

1.2.4 细胞免疫荧光检测

按照实验分组，向海马神经元培养基中添加携带GFP-AS及GFP-SS的慢病毒，继续培养72 h，部分神经元培养基中添加α-Syn(10 μmol/L)，37℃孵育1 h。细胞用PBS轻轻漂洗后，用预冷的4%多聚甲醛固定细胞30 min，1%BSA封闭1 h。将细胞与抗NMDAR NR1单克隆抗体(1∶1 000稀释)、抗Rab5B单克隆抗体(1∶1 000稀释)，于4℃反应过夜，然后与FITC标记的山羊抗鼠IgG，山羊抗兔IgG(1∶2 000稀释)反应2 h。荧光共聚焦显微镜观察结果。

1.2.5 蛋白提取物的制备

1)脑匀浆蛋白提取:将野生型及转α-Syn C57/B6小鼠处死后，剥离双侧海马体至杜恩斯组织匀浆器，加入适量蛋白裂解液(总蛋白裂解液或膜蛋白裂解液)匀浆，全程均在冰上操作。将脑组织匀浆15 000 g，1 h，4℃离心，上清即为总蛋白或膜蛋白，BCA法定量。

2)细胞蛋白提取:培养10～12 d的海马神经元用预冷的PBS洗2遍后加入蛋白裂解液(总蛋白裂解液或膜蛋白裂解液)，15 000 g，1 h，4℃离心，上清即为总蛋白或膜蛋白，BCA法定量。

1.2.6 Western blotting分析

7.5 %及12.5%的SDS-PAGE电泳分离蛋白质，半干法将蛋白质转移至 PVDF膜。PVDF膜与NMDAR NR1单克隆抗体(1∶1 000)，Rab5B抗体(1∶1 000)于4℃反应过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温反应1 h，ECL试剂盒检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 12.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 α-Syn促进原代海马神经元膜蛋白NMDAR1内在化

免疫荧光技术观察原代海马神经元胞膜的NMDAR NR1分布表达状况。如图1所示，正常培养的海马神经元中多数NMDAR NR1定位于细胞膜，少量位于细胞质。而 α-Syn预处理后，神经元多数NMDAR NR1定位于细胞质，发生内在化。

图1 α-Syn对原代神经元细胞表面NMDAR NR1的影响Fig.1 Effect of α-Syn on cell surface NMDAR NR1 expression in primary neurons

2.2 转α-Syn基因小鼠海马神经元中NMDAR NR1内在化增多

抽提野生型与转α-Syn C57/B6小鼠海马细胞质及全细胞蛋白行Western blotting分析，结果如图2A所示，转基因小鼠全细胞中含有较高的α-Syn水平。如图2B所示，转α-Syn C57/B6小鼠膜蛋白组分中NMDAR NR1较野生型小鼠降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，而全细胞蛋白组分中2组小鼠NMDAR NR1并无显著变化。图2C结果显示，转α-Syn C57/B6小鼠中Rab5B蛋白表达较野生型小鼠显著增高，且二者差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 Rab5B蛋白参与 α-Syn促进NMDAR NR1的内在化

如图3所示，外加α-Syn可促进NMDAR NR1下膜，而应用Rab5B反义核苷酸处理原代海马神经元后，可消除α-Syn促进NMDAR NR1内在化的作用。

图2 转α-Syn基因小鼠海马神经元中NMDAR NR1内在化增多Fig.2 Increased NMDAR NR1 internalization in hippocampal neurons of α-Syn transgenic mice

图3 抑制Rab5b表达对α-Syn引起的细胞表面NR1下调作用的影响Fig.3 Effects of Rab5b suppression on α-Syn-induced surface NR1 reduction

3 讨论

笔者发现在原代神经元及转基因动物水平，α-Syn仍然使神经细胞表面NR1表达减少，但不改变总的NR1表达量。NR1是NMDA受体的重要亚单位，其数量减少提示NMDA受体数量的减少。α-Syn减少细胞表面NR1而不改变总NR1表达量提示，α-Syn很可能通过引起NMDA受体内在化而下调细胞表面NMDA 受体含量［11］。

NMDA受体的内在化是通过内吞机制实现的［12］。有证据［13］表明，NMDA 受体的内吞受 Rab5B介导，因此推测，Rab5B可能参与了 α-Syn引起的NMDA受体内吞。为了证明Rab5B在α-Syn介导的NMDA受体内在化中起作用，本研究观察了α-Syn对Rab5B表达的影响，结果发现在细胞及动物水平，α-Syn均可上调Rab5B，并且其小干扰RNA可阻断α-Syn对NMDA受体的作用。以上结果均表明α-Syn是通过调节内在化相关蛋白Rab5B促进NMDA受体内在化。

NMDA受体广泛参与神经退行性疾病患者的兴奋性神经元损伤并引起其认知功能障碍。α-Syn对NMDA受体内在化的调控对揭示上述患者兴奋性神经元损伤并导致认知功能障碍起重要作用。

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