高表达重组人组织激肽释放酶7基因的前列腺癌单克隆细胞株的构建

林志弟，莫林键，张成东，宣 强，张悦宁，莫曾南，滕若冰，杨小丽，

(1广西医科大学第一附属医院;2广西医科大学医学科学实验中心)

前列腺癌是成年男性最常见的恶性肿瘤之一，在美国其发病率居男性恶性肿瘤首位，在我国其发病率逐年上升。重组人组织激肽释放酶7基因(Kallikrein 7，KLK7)是人类组织激肽释放酶基因家族的成员之一，编码hK7蛋白。研究显示该家族成员在多种恶性肿瘤组织中表达上升，可能为某些肿瘤的分子标记物［1］。本课题组前期研究发现，该基因在晚期前列腺癌组织中表达下降［2］。2012年3～9月，我们构建了高表达KLK7的前列腺癌稳定细胞株，旨在为KLK7在前列腺癌发生发展中作用的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 菌种、细胞、质粒 TOP10感受态菌及pcDNA3.1克隆表达载体购自美国Invitrogen公司;人类前列腺癌细胞系DU145购自中国科学院生物细胞所细胞库。构建重组载体所需反转录试剂盒、DNA聚合酶与限制性内切酶KpnⅠ购自TaKaRa公司;LipofectamineTM2000、Trizol Reagent及 SOC 培养基为美国Invitrogen公司产品;蛋白分子量Marker由赛百胜公司提供;PCR相关试剂为上海生物工程有限公司产品;细胞培养试剂购自Gibco公司;抗体购自Abcam公司。

1.2 人KLK7完整开放读码框(ORF)扩增 分离纯化人正常前列腺组织上皮细胞，Trizol法提取总RNA，-80℃保存备用。反转录合成 cDNA，行PCR扩增。为提高蛋白的表达效率，引物中设计引入KOZAK系列。上游引物:5'-ACCATGGCAAGATC CCTTCTCC-3';下游引物:5'-TTAGCGATGCTTTTTCA TGGTGTC-3'。PCR 反应条件:95 ℃ 、5 min，1个循环;95 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃ 、1 min，30个循环;最后72℃延伸10 min。扩增产物全长765 bp。产物于1.7% 琼脂糖胶电泳，凝胶成像系统检测。

1.3 真核表达载体构建 选择真核 pcDNA3.1表达载体。将PCR产物电泳后切胶纯化，T4 DNA连接酶将产物与pcDNA3.1表达载体进行连接。……