CAR siRNA对睾丸支持细胞上皮屏障通透性的影响及机制

李兴旺，赵艳玲

(温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江温州325027)

睾丸支持细胞位于曲细精管内基底膜附近，不仅为生精细胞的持续发育和分化提供结构上的支持和营养的供给，而且形成了一种非常重要的生理结构——血睾屏障，从而确保精子发生的顺利进行［1，2］。血睾屏障的构成和功能受到精密调控。如Occludin蛋白是一种紧密连接膜蛋白［3］，其磷酸化参与调节了精母细胞穿过血睾屏障过程中屏障功能的变化［4，5］。柯萨奇病毒—腺病毒受体(CAR)属于免疫球蛋白超家族，是广泛存在于上皮和内皮组织的一种紧密连接跨膜蛋白［6～8］。在大鼠生精上皮，CAR表达于支持细胞和处于迁移过程中的生精细胞［6，9］，但其生理作用目前尚不明了。本研究采用体外血睾屏障模型(支持细胞上皮屏障模型)，观察CAR小干扰RNA(si RNA)对支持细胞上皮屏障通透性的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、表皮生长因子(EGF)、大豆胰蛋白酶抑制剂、Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶S-Ⅰ型、DNA酶Ⅰ购自美国Sigma公司;24孔细胞培养板由美国Corning公司提供;MillicellOR-PCF型插入小室(膜面积为0.6 cm2)和MillicellOR-ERS(electrical resistance system)购自美国Millipore公司。单克隆兔抗Occludin抗体和FITC-山羊抗兔IgG分别购自美国Zymed Laboratories公司和英国Abcam公司。BX53荧光显微镜购自日本Olympus公司;Macprobe 5.1处理软件。凝胶成像系统购自美国Bio Rad公司;siRNA购自美国Ambion公司。

1.2 体外血睾屏障模型制备及分组 采用睾丸支持细胞原代双室培养方法［10，11］制备睾丸支持细胞上皮屏障，即体外血睾屏障模型。大鼠睾丸原代支持细胞经分离、接种、培养、纯化、鉴定而获得。……