金属离子对重组大肠杆菌发酵生产α—环糊精葡萄糖基转移酶的影响

罗宇笛　李啸　张江　石小丹

摘 要：本文研究了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响。首先，采用单因素分析确定几种微量元素的最佳产酶浓度；其次，通过两水平析因试验确定了关键的影响因子及其最大响应区域，其分别是MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O；最后，通过 Box-Benhnken中心组合试验建立数学模型，并采用响应面分析法获得了微量元素的最优配比参数为：MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O 0.51 mmol·L-1， CaCl2·5H2O 3 mmol·L-1。与对照组相比，酶活提高了1.4倍。

关键词：大肠杆菌；α-环糊精葡萄糖基转移酶；金属离子；响应面设计

中图分类号：Q93-335 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.12.003

α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-Cyclodextrin Glycosyltransferase，简称α-CGT酶，EC 2.4.1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成员，是微生物所产的胞外酶，能够催化4种反应——歧化反应、环化反应、偶合反应和水解反应[1-3]。

天然的CGT酶大部分来自嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱脂肪芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和软化芽孢杆菌，而构建的基因工程菌为大肠杆菌[4]。基因工程菌在生长和产酶过程中需要无机盐维持细胞的渗透压，并合成核酸等物质；一些微量元素如钙、铁、锌对酶活性中心或辅酶的生成以及酶激活剂的作用有着重要影响[5-8]。本研究采用单因素实验、两水平析因实验、中心组合设计实验和响应面分析法探讨了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响，并得到优化的配比，为α-环糊精葡萄糖基转移酶的生产具有一定的指导意义。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种 重组大肠杆菌 E.coli BL21（DE3），由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 试剂 酵母浸出物 （FM818，简称YE）由安琪酵母股份有限公司生产；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生产；其他试剂均为分析纯AR。

1.1.3 培养基 斜面培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0， K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5，琼脂粉16。

液体培养基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0，K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 方 法

1.2.1 种子培养 将斜面菌样接入装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，制备2瓶，在37 ℃和200 r·min-1 摇床上培养8 h。

1.2.2 发酵培养 将5 mL种子瓶菌样接入装有100 mL液体培养基的500 mL三角瓶中，制备6瓶，在30 ℃和180 r·min-1摇床上培养40 h。

1.2.3 菌体生物量的测定 采用分光光度计测定发酵液在600 nm波长处的吸光度OD600。

1.2.4 周质空间中α-CGT酶的制备 取一定量菌体的发酵液于4 ℃、6 000 r·min-1下离心10 min，倒去上清液。用蒸馏水洗涤细胞沉淀2遍，离心（同上）后取2 g左右菌体细胞，按照比例1： 10（m/v）加入对应体积的Tris-EDTA缓冲液混合均匀。细胞悬液使用超声波细胞破碎仪进行破碎后，于4 ℃、4 000 r·min-1下离心5 min，所得上清液为周质空间中α-CGTase酶活测定液。

1.2.5 α-CGT酶环化活力的测定 甲基橙法测定环化活性：取离心后并适当稀释的发酵上清液100 μL，加入装有900 μL预先用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液（pH值6.0）配制的1%（W/V）麦芽糊精溶液的试管中，在40 ℃下反应10 min后，加入1.0 mL浓度为1.0 mol·L-1的盐酸终止反应，再加入1.0 mL的用50 mmol·L-1的磷酸缓冲液配制的0.1 mmol·L-1甲基橙溶液，20 ℃下保温15 min，在508 nm处测定吸光度。对应α-环糊精标准曲线计算出环糊精浓度，一个酶活单位（U）定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol的α-环糊精所需的酶量[9-10]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

从10种微量元素中初步筛选出Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+这4种显著因素，分别以不同浓度加入发酵培养基中，以空白为对照，测定酶活，结果如表1所示。

从表1可以看出，4种金属离子在较低浓度情况下都对酶活有一定的提高作用，同时，在所设计的离子浓度梯度中，均发现了峰值。为了得出这4种金属离子的最佳配比浓度，需要做进一步的试验。

2.2 两水平析因实验及结果

在单因素试验基础上，利用Design Expert Software（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA， Version 8.0）软件设计24-2 两水平部分析因试验（FFD），考察MgSO4·7H2O（X1）、CaCl2·5H2O（X2）、FeSO4·7H2O（X3）、MnSO4·H2O（X4）4个因素对基因重组大肠杆菌生长和产酶的影响以及各因素之间的交互作用，以确定影响产酶的显著因素。各因素规范值与实际值的设定水平及试验结果见表2。

3

根据回归分析结果（表3），得到线性回归方程，其中包括FFD试验所有项，如下：