犬乳腺癌预后分子标记的筛选

叶云+钟英英+张倩

摘要：为了获得犬乳腺癌转移早期的分子标记，比较了27个淋巴结转移/不转移犬乳腺癌样本的基因芯片数据，获得了775个差异表达基因，并用Cox比例风险模型进行基因表达的单因素分析得到38个与生存显著相关的基因。在此基础上用惩罚Cox模型对样本进行生存预测，得到10个基因的分类器，可以比较准确预测样本的预后风险，准确率可达到92.3%。这些基因与雌激素代谢、细胞分化、转录等生物学过程相关，可能为犬乳腺癌预后分子标记和治疗靶标，这将给犬乳腺癌的临床诊断和治疗提供新的思路。

关键词：淋巴结转移;犬乳腺癌;预后标记;基因芯片

中图分类号：S829.2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）20-4912-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.036

Screening Prognosis Markers for Canine Mammary Tumor

YE Yun，ZHONG Ying-ying，ZHANG Qian

（College of biological and chemical engineering， Guangxi university of science and technology， Liuzhou 545006， Guangxi，China）

Abstract： As one of the most important prognostic factors in the diagnosis of canine mammary tumor， lymph node metastasis was an early step in metastasis. In order to find out the markers in early stage， 27 microarray data of lymph node metastasis positive or negative samples of canine mammary carcinomas were analyzed. 775 significantly differentially expressed genes were obtained. The univariate analysis using Cox proportional hazards model showed that 38 genes were significantly related with survival. 10-gene classifier obtained by penalized Cox proportional hazards model was used to predict the risk of canine mammary tumor samples. The accuracy was 92.3%. These genes were associated with the pathways of estrogen metabolism， cell differentiation， transcription and so on， and might be prognostic molecular markers and potential therapeutic targets. It will provide a new way for the diagnosis and therapy of canine mammary tumor.

Key words： lymph node metastasis; canine mammary tumor; prognosis marker; microarray

乳腺肿瘤是母犬最常见的肿瘤。在犬乳腺癌中，淋巴结转移是临床诊断的重要指标，也是发生远处转移的早期事件，伴随着远处转移的发生，往往会导致犬类的死亡[1]。早期检测是有效治疗乳腺癌并延长动物生存时间的有效途径，而淋巴结转移发生的分子机制仍然不够清楚，传统的病理检验也难以找到更好的检测指标。因此，很有必要开发新的生物标记来检测早期的犬乳腺癌。乳腺癌转移是多基因参与和调控的过程，利用基因芯片技术可以从全基因组水平了解淋巴结转移所发生的基因表达变化，从而筛选出与预后有关的分子标记，为犬乳腺癌的诊断和治疗提供更好的理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

本研究采用的基因芯片数据来自美国国立生物技术信息中心（NCBI）的公共数据库GEO（Gene expression omnibus），编号为GSE20718，为Affymetrix 公司的Canine Genome 2.0 Array平台的芯片，共包含13个淋巴结转移的犬乳腺癌和14个不转移的犬乳腺癌样本，生存时间大于24个月的样本有13个，小于24个月的有12个，最短生存时间为1个月，有2个样本生存时间缺失。

1.2  淋巴结转移相关差异基因的筛选

芯片数据的统计学分析采用BRB-ArrayTools（Version4.2.1）软件包来进行，首先采用倍值过滤和表达水平过滤等方法对数据进行筛选：去除两类样本的基因中位数值小于2倍、表达值小于100的数据，以获得质量可靠的信号点，合并相同基因的探针。将通过过滤标准的基因进行两样本非配对样本t检验（P<0.001，FDR<0.01），筛选淋巴结转移与原位肿瘤之间的差异表达基因。

1.3  生存分析及预测

将筛选得到的淋巴结转移相关的差异基因作为候选基因，以术后生存时间作为生存时间变量，是否死亡作为生存状态，采用Cox比例风险模型和Wald Statistic，在BRB-ArrayTools中对基因表达进行单因素分析，进一步筛选出与生存显著相关的基因（P<0.001），用Kaplan-Meler法作图分析这些基因表达对术后生存的影响。在此基础上，将样本分成两组，其中一组为训练组（Training，n=12），另外一组作为验证组（Test，n=13），用惩罚Cox模型对样本进行生存预测。100次随机对数秩检验（Log-rank test），采用留一法（Leave-one-out）进行验证，获得小于10个基因的分类器用于预测样本的预后，将样本分为低风险和高风险两组。由于病例样本中有两例生存时间缺失，因此只有25例样本用于生存分析。另外，生存时间大于24个月的样本在分析中定为24个月。

1.4  基因功能注释

通过在线分析工具对生存分析相关的基因进行基因本体（Gene ontology，GO，www.geneontology.org）注释，并通过文献挖掘，找到这些基因相应的生物学功能及其对应的生物学通路，从而探讨这些基因对犬乳腺癌预后可能存在的影响机制。

2  结果与分析

2.1  淋巴结转移相关基因的获得

通过初步数据过滤，共有3 507个基因符合过滤标准。然后，对13个淋巴结转移的犬乳腺癌和14个不转移的犬乳腺癌样本进行随机方差模型的两样本t检验，转移/不转移的两组样本间表达倍数大于2的探针为差异表达基因，按此标准获得了775个差异表达基因，其中上调基因496个，下调基因201个。

2.2  生存相关基因的获得

合并共同基因的探针，将上述获得的淋巴结转移差异基因用于生存分析。由于只将样本分为两个样本组，因此，在Cox比例风险模型用24个月作为分界点。基因表达的单因素分析得到38个与术后生存显著相关的基因（P<0.001），其中10个基因在预后好的样本中高表达，28个基因在预后差的样本中高表达。

2.3  生存预测及相关基因功能注释

经过100次随机Log-rank test，留一法进行交叉检验，从生存相关的基因中筛选到10个基因的分类器，Kaplan-Meler生存曲线表明，分类器可以将样本分为高风险和低风险两个组（P<0.05，图1）。由于在分析中只分两个风险组，因此，构建风险分组的预后指数百分数为50，样本的预后指数大于1即为高风险，反之小于1则为低风险。

对Test组的生存预测结果如表1所示，13个样本中低风险样本有7个，另外的6个样本则被预测为高风险。低风险样本的实际术后生存时间均超过24个月，而高风险样本中除了GSM520212的实际术后生存时间超过24个月之外，其他5个样本的术后生存时间均不到10个月，预测准确率达到92.3%。如表2所示，经过基因本体分析（GO），分类器的10个基因中，只有LOC611412功能未知。其余的9个基因中，SULT1E1与雌激素活化有关，FST参与细胞分化和卵泡刺激素的负调控等生物学过程，GTF2A2和MITF都与转录调控相关，ETFDH和LOC475273则与氧化应激、电子传递等生物学功能有关。

3  讨论

淋巴结转移与犬乳腺癌的预后关系密切，本研究用生物信息学的手段从淋巴结转移的差异基因中筛选出38个与犬乳腺癌生存显著相关的基因，由此筛选出的10个基因分子分类器能比较准确预测犬乳腺癌病例的预后风险，准确率达到92.3%。这些基因与细胞分化、雌激素代谢及转录等生物学过程相关，可作为犬乳腺癌预后分子标记的候选基因。其中，SULT1E1为硫酸基转移酶（Sulfotransferases，SULTs）SULT1家族的主要成员之一，是目前所发现的13种同功酶中对雌激素催化作用最强的酶[2]。有研究指出SULT1E1基因表达下调可导致雌激素依赖性肿瘤的发生、发展，可作为独立的判断乳腺癌预后的指标[3]。本研究通过基因表达的单因素生存分析结果也表明，SULT1E1基因在预后差的样本（n=12）中低表达，而在生存期大于24个月的样本中均高表达（n=13）。作为重要的解毒酶类，SULT1E1可以将PAPS的硫酸根转移至雌激素的3-羟基上，形成水溶型无活性硫酸化雌激素，从而降低循环及靶组织中雌激素暴露水平[4]。乳腺癌是雌激素依赖性肿瘤，SULT1E1基因低表达会使雌激素活性增加，从而增加乳腺组织暴露于雌激素的机会增加。FST是编码的蛋白是一种单链糖蛋白，在脑、乳腺、肾脏等组织中均有表达，在卵巢组织中浓度最高[5]。FST的高表达有利于卵巢癌的治疗。FST的表达受到一个BRCA1基因的调控，高水平的BRCA1可提高FST的表达[6]。BRCA1被认为是一种乳腺癌的抑癌基因，编码一种DNA结合蛋白，在正常乳腺上皮细胞的转录中起重要调控作用，抑制细胞进入增殖周期[7]。基因表达谱分析表明，FST在预后好的犬乳腺癌样本（n=13）中高表达，这表明可能在预后好的样本中BRCA1存在一定的表达量。由于BRCAl蛋白表达缺失与乳腺癌恶性程度、预后差有一定关系[8]，因而BRCA1的表达有利于乳腺癌的预后。

肿瘤的发生发展是多个基因共同作用的过程，高通量的基因表达谱分析可以从全基因组水平较为全面了解肿瘤发生的机制。利用高通量方法筛选犬乳腺癌的预后分子标记，可为动物乳腺癌乃至人乳腺癌的临床诊断和治疗提供了更加丰富的研究手段。

参考文献：

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