GM-CSF 与生长抑素共表达基因疫苗的构建和鉴定

魏金钢，韩晓萍，刘英俊，兰芳菲，梁爱心，吴红翔，舒邓群*

(1.江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045;2.华中农业大学 动物科学技术学院，湖北 武汉 430070)

生长速度、产肉率和饲料利用率等是衡量肉用动物生产性能的主要指标，动物的生长既可以从营养方面调控，也可以通过动物生长轴的调控进行调节。动物生长轴是由动物体内下丘脑-垂体-靶器官及其相关的激素和受体所组成的具有自动调节的神经内分泌系统，下丘脑分泌生长激素释放因子(growth hormone-releasing factor，GRF)和生长抑素(somatostatin，SS)，GRF 促进垂体加强生长激素(growth hormone，GH)的分泌，从而促进动物的生长;生长抑素则抑制垂体分泌生长激素，从而抑制动物的生长。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一个具有多项潜能的造血生长因子，不仅能刺激造血祖细胞增殖、分化和成熟，而且还能活化中性粒细胞、巨噬细胞、DC 及其它单核细胞，常用作DNA 疫苗的免疫佐剂，以提高DNA 疫苗的免疫效果［1］。舒邓群等以猪的真核表达质粒pGM-CSF 为模板，构建GM-CSF 与SS 融合表达质粒(pGM-CSF/SS)，免疫小鼠后，可增强小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力，提高生长抑素抗体的P/N 值［2］，提高肌肉组织中GHR 和IGF-I mRNA 的表达［3］。本研究利用动物的生长轴的原理，采用生物工程的方法，应用共表达载体pIRES 将GM-CSF 基因和SS 基因分别克隆到载体的多克隆位点A 和B，构建共表达基因疫苗，旨在同时表达GM-CSF 和SS 两种蛋白，研究基因佐剂GM-CSF 对生长抑素的免疫增强作用，为提高动物的生产性能提供理论基础。

图1 pIRES 质粒结构Fig.1 Structure of pIRES plasmid

1 材料与方法

1.1 质粒和菌种

质粒pIRES 由暨南大学医学院血液病研究所李扬秋老师惠赠，质粒结构见图1。质粒pVGS/2SS-asd 由华中农业大学杨利国教授惠赠［4］，该质粒包括GM-CSF 片段和含有乙肝表面抗原的2SS 片段，E.coli DH5α受体菌购于天根生物有限公司。

图2 pIRES-GM-CSF/2SS 质粒的构建图Fig.2 Schematic illustration for construction of pIRES-GM-CSF/2SS

1.2 酶和试剂

Taq DNA 聚合酶;DNA 分子量标准DL5000 和DL10000;pEASYTM-T1 Simple T载体;T4DNA 连接酶均购自北京全式金有限公司;PCR 产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒由北京原平皓公司生产;限制性内切酶Xba Ⅰ、Nhe I、EcoR Ⅰ、Not I、Sal I 购 于Toyobo 公司;其它试剂均为国产分析纯。GM-CSF 与SS 共表达质粒构建的技术路线见图2。

1.3 引物的设计与合成

采用Primer 5.0 软件设计引物，分别根据猪的GM-CSF 序列［5］和2SS 片段(含有乙肝表面抗原S 基因)序列设计扩增GM-CSF 和2SS 片段的引物［6］(表1)，设计引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 目的基因引物参数Tab.1 Parameter of oligo-nucleotide primer pairs for the target genes

1.4 pIRES 质粒的提取与酶切

将pIRES 质粒转入感受态大肠杆菌E.coli DH5α中，铺板与扩大培养后挑取单菌落进行培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒pIRES，然后进行酶切，酶切体系为:10×M buffer 1.0 μL、XbaⅠ0.2 μL、EcoR I 0.2 μL、pIRES 质粒2 μL、ddH2O 至总体积10 μL，37 ℃，反应2～3 h，酶切后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.5 pIRES-GM-CSF 质粒的构建

1.5.1 GM-CSF 基因的扩增 按试剂盒说明书抽提和纯化pVGS/2SS-asd 质粒。以pVGS/2SS-asd质粒为模板，按照如下PCR 反应体系进行GM-CSF 基因的扩增:5×Buffer 2 μL、d NTP 0.4 μL、Taq DNA 聚合酶0.4 μL、引物p1、p2 各0.5 μL、pVGS/2SS-asd 质粒1.5 μL、ddH2O 至合计20 μL。按以下条件进行PCR 反应:94 ℃变性6 min，然后，94 ℃变性1 min、51 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 个循环后72 ℃续延10 min、16 ℃降温5 min。PCR 产物1.0%琼脂糖电泳检测，胶回收，纯化和定量，备用。

1.5.2 GM-CSF 基因与T 载体相连 按照如下连接体系将GM-CSF 基因与T 载体进行相连:PCR 的产物GM-CSF 4 μL、T-载体1 μL，35 ℃反应15 min，将反应产物转化感受态DH5α中，培养后，采用质粒提取试剂盒提取质粒TGM-CSF 质粒。然后按以下酶切体系进行酶切鉴定:T-GMCSF 质粒2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer 1 μL、加ddH2O 至总体积10 μL，鉴定正确的质粒送往北京奥科生物技术有限公司测序，备用。

1.5.3 pIRES-GM-CSF 质粒的构建 纯化后的pIRES 质粒和TGM-CSF 质粒分别用Nhe I 和EcoR I 双酶切，酶切体系分别为:pIRES 质粒12 μL、Nhe I 0.4 μL、EcoR I 0.8 μL、10×M Buffer2 μL、加dd H2O 至总体积20 μL;TGM-CSF 12 μL、Nhe I 0.2 μL、EcoR I 0.2 μL、10×M Buffer 2 μL、加ddH2O 至总体积20 μL，37 ℃，反应2～3 h，酶切后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳，分别分离回收pIRES 大片段和GM-CSF 片段，备用。

然后，将回收、纯化的pIRES 大片段和GM-CSF 片段按如下体系进行连接反应:pIRES 载体线性片段1 μL、GM-CSF 线性片段4 μL、5×T4Ligase Buffer 2 μL、T4DNA Ligase 1 μL、dd H2O 2 μL、共计10 μL，23 ℃水浴，连接20 min。

1.5.4 阳性重组质粒(pIRES-GM-CSF)的筛选和鉴定 将连接产物转化感受态E.coli DH5α细菌，固体培养基铺板培养，挑取阳性克隆，LB 培养，提取质粒DNA，进行酶切鉴定，酶切体系为:阳性克隆2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer 1 μL、ddH2O 至总体积10 μL，37 ℃，反应2～3 h，1.0%琼脂糖电泳检测，电泳条带与目的条带大小相符，鉴定正确的质粒送往北京奥科生物技术有限公司测序，获得的阳性克隆命名为pIRES-GM-CSF。

1.6 pIRES-GM-CSF/2SS 质粒的构建

1.6.1 2SS 基因的扩增 以pVGS/2SS-asd 质粒为模板，按照如下PCR 反应体系进行SS 基因的扩增:5×Buffer 2 μL、d NTP 0.4 μL、Taq DNA 聚合酶0.4 μL、引物p3、p4 各0.5 μL、pVGS/2SS-asd 模板1.5 μL、ddH2O 至总体积20 μL，按以下条件进行PCR 反应:94 ℃变性6 min，然后94 ℃变性1 min、54.9 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35 个循环后，72 ℃续延10 min、16 ℃降温5 min，PCR 产物1.0%琼脂糖电泳检测，胶回收，纯化和定量，备用。

1.6.2 T2SS 质粒的构建 将2SS 的PCR 产物与T 载体相连，连接体系:PCR 的产物2SS 4 μL、T 载体1 μL、35 ℃反应15 min，反应结束后放于冰上。然后将阳性质粒转入DH5α，进行培养扩增，提取T2SS质粒进行酶切鉴定，酶切体系为T2SS 2 μL、Not I 0.2 μL、Sal I 0.2 μL、10×H Buffer 1 μL、dd H2O 至总体积共计10 μL，酶切产物进行1.0%琼脂糖电泳检测，同时，将鉴定正确的质粒送往北京奥科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒进行保存备用。

1.6.3 pIRES-GM-CSF/2SS 质粒的构建 纯化后的pIRES-GM-CSF 质粒和T2SS 质粒分别采用NotI 和SalI 双酶切pIRES-GM-CSF 质粒酶切体系为:pIRES-GM-CSF 质粒12 μL、Not I 1 μL、Sal I 1 μL、10×H Buffer 2 μL、dd H2O 至总体积20 μL;T2SS 质粒酶切体系为:T2SS 11.2 μL、Not I 0.8 μL、Sal I 1 μL、10×H Buffer 2 μL、dd H2O 至总体积20 μL。分别在37℃，反应2～3 h，回收、纯化的pIRES-GM-CSF 大片段和2SS 片段，1.0%琼脂糖电泳检测，酶切产物保存备用。

将回收、纯化的pIRES-GM-CSF 大片段和2SS 片段按如下体系进行连接反应:pIRES-GM-CSF片段1 μL、2SS 线性片段5 μL、5×T4Ligase Buffer2 μL、T4DNA Ligase 1 μL、dd H2O 至总体积10 μL，23℃水浴，连接20 min。连接产物备用。将连接产物转化感受态E.coli DH5α细菌，固体培养基铺板培养，挑取阳性克隆，LB 培养，提取质粒DNA。

1.6.4 pIRES-GM-CSF/2SS 的酶切鉴定和测序 将上述提取的质粒按如下体系进行酶切鉴定:酶切体系1:阳性克隆2 μL、Nhe I 0.1 μL、EcoR I 0.3 μL、10×M Buffer1 μL、dd H2O 至总体积10 μL;酶切体系2:阳性克隆2 μL、Not I 0.2 μL、Sal I 0.2 μL、10×H Buffer 1 μL、dd H2O 至总体积10 μL，37 ℃，反应2～3 h，1.0%琼脂糖电泳检测，将鉴定正确的质粒送往北京奥科生物技术有限公司测序，获得的阳性克隆命名为pIRES-GM-CSF/2SS。

2 结果与分析

2.1 pIRES 质粒提取

用试剂盒提取目的质粒，用TE 溶解后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3 所示。由图3 可见，在5 000 bp 之后有条6 100 bp 的条带，与pIRES 质粒大小相符，而且，OD260/OD280值均在1.8～2.0 之间，说明DNA 纯度较高，可直接用于酶切反应。再用Xba I 和EcoR I 酶切pIRES 质粒，结果见图4。由图4 可以看出，在500～750 bp 之间有条651 bp 的条带，与IRES 片段大小相符。

图3 pIRES 质粒Fig.3 pIRES plasmid

图4 pIRES 质粒的酶切Fig.4 Digestion of pIRES plasmid

2.2 GM-CSF 片段的扩增

采用pVGS/2SS-asd 模板，通过PCR 的方法扩增GM-CSF 的片段，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图5 所示，由图5 可见，在250～500 bp之间有条465 bp 条带，与GM-CSF 片段的大小符合。

2.3 TGM-CSF 质粒的提取

将T 载体与GM-CSF 片段连接，35 ℃、反应15 min，然后转化感受态的大肠杆菌，提取质粒鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6 所示。由图6可见，在3 000～5 000 bp 之间有条4 299 bp 的条带，与TGM-CSF 质粒的大小相符。

2.4 TGM-CSF 质粒的双酶切鉴定

用EcoR I 和Nhe I 对TGM-CSF 质粒进行双酶切，37 ℃酶切3 h，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7 所示。由图7 可见，3 829 bp 的条带为T 载体，与T 载体的大小相符;另外，在图还可看到条465 bp 的条带，与GM-CSF 片段的大小相符。

图5 GM-CSF 的PCR 片段Fig.5 GM-CSF fragment by PCR

图6 TGM-CSF 质粒Fig.6 TGM-CSF plasmid

图7 TGMCSF 质粒酶切Fig.7 Digestion of TGM-CSF plasmid

2.5 pIRES-GM-CSF 质粒的鉴定

将pIRES 质粒和TGM-CSF 质粒分别用EcoR I和Nhe I 双酶切，37 ℃酶切3 h，然后回收pIRES 的大片段和GM-CSF 片段，回收的片段后在23 ℃水浴环境下连接20 min，然后导入大肠杆菌，提取质粒用EcoR I 和Nhe I 双酶切鉴定，37 ℃酶切3 h，酶切结果用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图8 所示。由图8 可见，一条6 089 bp 的条带与pIRES 载体的大小相符，还有一条465 bp 的条带与GM-CSF 目的片段的大小相符。

2.6 PCR 扩增SS 目的基因

以pVGS/2SS-asd 质粒为模板扩增SS 基因，扩增结果1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9 所示。由图9 可见，有一条822 bp 的条带，与预期的2SS 片段的大小相符。

图8 pIRES-GM-CSF 酶切Fig.8 Digestion of pIRES-GM-CSF plasmid

图9 扩增的SS 片段Fig.9 PCR fragment of 2SS

2.7 T2SS 质粒的鉴定

将SS 片段回收后与T 载体连接，35 ℃反应15 min，回收后导入大肠杆菌，提取质粒。用EcoR I和Nhe I 酶切质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图10 所示。由图10 可见，有条822 bp 的条带，与预期的2SS 片段大小相符。

2.8 pIRES-GM-CSF/2SS 的鉴定

分别用Not I 和Sal I、EcoR I 和Nhe I 酶切共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图11 所示。从电泳图中可以看出有条465 bp 的条带，与目的片段GM-CSF 的大小相符，另有条822 bp 的条带，与目的片段2SS 的大小相符。

图10 T2SS 酶切Fig.10 Digestion of T2SS

图11 pIRES-GM-CSF/2SS 酶切Fig.11 Digestion of pIRES-GM-CSF/2SS plasmid

3 讨论

曹少先等成功构建了生长抑素基因疫苗pcS/SS，且在真核细胞中都得到很好的表达，具有SS 的反应原性，用pcS/SS 免疫SD 大鼠，50 μg 的剂量表现出良好的免疫反应性，抗体阳性率为60%［6］。但由于种与种之间的免疫遗传差异，DNA 疫苗对大动物特别是对哺乳动物，免疫原性差［7］，免疫效果往往不理想，因而影响DNA 疫苗的实用性。要获得效力更持久、免疫应答更强以及最优化的免疫应答，需进一步改善DNA 疫苗的免疫应答。使用重组的细胞因子蛋白或质粒编码的细胞因子作为基因佐剂，即采用将抗原基因与细胞因子质粒联合注射、融合表达或共表达的方式，可增强机体免疫应答效率，提高免疫效果。

GM-CSF 由多种细胞分泌，能够刺激和活化专业的APC，可提高体液免疫和CTL 应答，因而是基因免疫中极有应用前景的细胞因子［8］。大量研究表明，编码GM-CSF 的质粒能增强DNA 疫苗的免疫效果［9］。

目前基因疫苗与基因佐剂表达的方式有以下3 种:(1)共注射:采用表达质粒分别构建基因疫苗和佐剂质粒，然后在动物的不同部位分别注射这两种质粒。李琳等同时对小鼠注射pcDNA3/mGM-CSF和pcDNA3/MDC-VP1，发现GM-CSF 基因对pcDNA3/MDC-VP1 有免疫增强的作用，但是其存在操作相对来说比较繁琐，可能存在局部免疫不均匀［10］。(2)共免疫:采用表达质粒将目的基因与佐剂以融合表达的形式构建融合表达基因疫苗。舒邓群等首先成功构建了融合表达基因疫苗pGM-CSF/SS，通过小鼠口服融合表达疫苗pGM-CSF/SS 的免疫方式，观察其对小鼠淋巴细胞增殖和GH、IGF-Ⅰ分泌的影响，发现pGM-CSF/SS 的免疫效果优于pGM-CSF+pcS/2SS 组［11］。(3)共表达基因疫苗:在一个共表达质粒的两个多克隆位点上同时克隆目的基因和佐剂基因，可同时表达2 个完全独立的蛋白。李闯等构建的TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8 的共表达载体，转染A549 和Molt4 细胞后，在mRNA 和蛋白水平检测到了TCR Vα1 和TCR Vβ8 的表达，为利用特异性TCR 基因修饰T 细胞的研究提供方法学依据［12］。韩雷等构建了pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4 质粒，并且在转染COS-7 细胞，提取总RNA和总蛋白，进行RT-PCR 和Western-blot 分别检测到目的基因和目的蛋白［13］。

IRES 序列来源于脑心肌炎病毒(ECMV)，它具有不依赖于5'帽子结构的翻译起始，pIRES 载体质粒上有两个多克隆位点MCSA 和MCSB，当目的基因被克隆进这两个位点时，该载体能够同时翻译出两种目的蛋白。Camille Allera-Moreau 等用光度计检测到连接了IRES 的FGF-1 和FGF-2 基因在小鼠肌肉细胞中的表达［14］。Liu S 等通过构建pIRES-Sj97-Sj14-Sj26 免疫小鼠，通过ELISA 检测抗体和MTT 法检测CD4+and CD8+T 细胞增值，发现其与对照组相比能够增强小鼠的免疫力［15］。胡刚等首先构建了pIRES-PML-RARα-hIL-2 重组质粒，然后转染A549 细胞，通过点杂交试验和ELISA 检测到这两个基因的表达［16］。黄梅娟等分别构建了pIRES-Jurkat Vβ8、pIRES-Molt4 Vβ2(1)和pIRES-Molt4 Vβ2(2)三种质粒，首先通过测序证明质粒构建的正确性，然后转染K562 细胞，通过间接免疫荧光法、SDS-PAGE 和Western-blotting 等检测其能够表达相应的目的蛋白［17］。

本研究利用共表达载体pIRES，分别在核糖体进入位点(IRES)的两个多克隆位点(MCSA 和MCSB)分别克隆GM-CSF 基因和SS 基因，成功构建了含GM-CSF 基因和SS 基因的共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS，为共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS 的后续研究奠定了良好的基础。

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