油菜蜂花粉的抗氧化活性

饶剑，吴盼盼，徐德平

(江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

花粉(pollen)是植物雄蕊所产生雄性生殖细胞，它集中了整个植物的精华，含有丰富的营养成分和药用成分，被誉为完全营养素、微型营养库［1］，它富含蛋白质、不饱和脂肪酸、酚类、黄酮类、磷脂、多种维生素和微量元素［2-3］。油菜蜂花粉是蜜蜂在采集的油菜花粉上加入花蜜和唾液形成的团粒状物，具有很好的抗氧化、降血脂、抗前列腺增生、提高免疫力和抗肿瘤等诸多生理活性［4-5］。因此研究油菜蜂花粉的抗氧化性对其开发利用具有重要意义。

目前对花粉的抗氧化性研究主要集中在酚类化合物中，包括黄酮类和酚酸类化合物。近来有研究表明，花粉中还有很多成分具有很好的抗氧化性，如邓建军［6］等发现20% ～40%浓度硫酸铵盐析得到的油菜蜂花粉水溶性蛋白对DPPH和·OH自由基具有很强的清除能力;何伟［7］等研究表明，蜂花粉油脂表现出较强的抗氧化力。但这些研究均以抗氧化活性评价为目的，未明确花粉中抗氧化物质基础。在本文的研究中发现，油菜蜂花粉脂溶性成分具有很好的抗氧化性。本课题通过体内和体外2种方法研究油菜蜂花粉中脂溶性成分的抗氧化性，同时对具有抗氧化活性的部分进行研究并通过核磁等手段确定其物质结构。

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

油菜蜂花粉:购于南京老山药业有限公司;昆明小鼠60只，雌雄各半，6周龄，20～25 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司;D-半乳糖:美国Sigma公司;总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒，蛋白定量试剂盒，丙二醛(MDA)测试盒，单胺氧化酶(MAO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;GF254硅胶板，山东烟台芝罘化工厂;ODS填料，Nacalai Tosoh Inc;MCI填料，Mitsubishi Chemical Corporation;其他试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 仪器和设备

DFY-600摇摆式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司;CQ-005型萃取罐，常州市特威电气自动化系统有限公司;中压输液泵，天津科器高新技术公司;R-1002型旋转蒸发仪，上海申顺生物科技有限公司;TU-1900型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;MLS-3780高压蒸汽灭菌器，日本 Sanyo公司;CR3i高速冷冻离心机，美国Thermo公司;核磁共振仪 Avance 500MHz，Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 油菜蜂花粉的提取

将油菜蜂花粉粉碎过80目筛，称取15 kg加入100 L萃取罐中，以料液比1∶5(g∶mL)加入体积分数为90%乙醇溶液，回流提取3 h，过滤出清液，将滤渣再按上述方法重复提取2次，合并清液减压浓缩至适宜体积为止。加入适量的水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩至干，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及萃余物，后冷藏备用。

1.3.2 各萃取物总抗氧化能力的测定

取以上四种萃取物配制10 mg/mL试样，按照TAOC试剂盒说明进行操作，在520 nm处测吸光度。试验重复3次，取平均值。本实验以样品管与对照管在520 nm处的吸光度的差值(ΔA520)的大小来反映其总抗氧化能力，差值越大，总抗氧化能力越强。

1.3.3 各萃取物对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠的抗氧化作用

1.3.3.1 D-半乳糖诱导衰老小鼠模型建立

昆明小鼠适应性饲养一周后，随机分成6组，每组10只，雌雄小鼠各5只。正常对照组和衰老模型组小鼠灌胃等体积生理盐水;实验组分别灌胃4种萃取物200 mg/(kg·d)。灌胃同时衰老模型组和实验组每日皮下注射D-半乳糖500 mg/(kg·d)，建立小鼠亚急性衰老模型，连续6周［8-10］。正常对照组每日皮下注射等体积生理盐水。

1.3.3.2 样本制备和生化指标测定

末次给药24 h后，将动物断颈处理，摘取脑、肝、脾，脾脏用滤纸吸干残血，称质量，计算器脏指数。肝和脑分别低温研磨制成10%的组织匀浆，3 500 r/min，4℃条件下离心10 min，取上清液，-20℃保存。采用比色法测定肝组织的MDA含量及脑组织的MAO活力，蛋白采用 Lowry等［11］的方法测定，按试剂盒说明书操作。

1.3.3.3 统计分析

1.3.4 抗氧化部分的分离纯化与结构鉴定

将抗氧化性部分过 MCI反相柱(6 cm×100 cm)，流速15 mL/min，用乙醇溶剂梯度洗脱，洗出液用锥形瓶收集，TLC法跟踪检测洗脱液，将Rf值和显色反应一致的洗脱液合并减压浓缩得到不同的细分部分，将各细分部分分别反复上ODS-B(3 cm×100 cm)、ODS-A(3 cm×100 cm)等色谱柱分离，用乙醇溶剂梯度洗脱，自动收集器15 mL/管收集洗脱液，采用TLC薄层法检测，从石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中各得到3个化合物。以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，四甲基硅烷(TMS)为内标物，经1H NMR、13C NMR等手段鉴定其化学结构。

2 结果与讨论

2.1 油菜蜂花粉不同萃取物的总抗氧化力(TAOC)的测定

从油菜蜂花粉中得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、萃余物的总抗氧化力如图1所示。由图1可知，石油醚萃取物总抗氧化力活性最强，ΔA520值达0.36，乙酸乙酯萃取物活性其次，ΔA520值达达0.31，正丁醇萃取物、萃余物几乎没有总抗氧化力。表明油菜蜂花粉乙醇提取物中抗氧化活性物质主要集中在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

图1 油菜蜂花粉中不同萃取物总抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of different extracts in Rape Bee Pollen

2.2 油菜蜂花粉不同萃取物对小鼠抗氧化力的影响

从油菜蜂花粉中得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、萃余物4个部分对肝组织MDA水平和脑组织MAO活力影响如表1所示。

表1 油菜蜂花粉各萃取物对D-半乳糖诱导衰老小鼠抗氧化力影响(±S，n=10)Table 1 The antioxidant activity effects of each extract from Rape Bee Pollen for D-galactose induced aging mice(±S，n=10)

表1 油菜蜂花粉各萃取物对D-半乳糖诱导衰老小鼠抗氧化力影响(±S，n=10)Table 1 The antioxidant activity effects of each extract from Rape Bee Pollen for D-galactose induced aging mice(±S，n=10)

注:“*”表示与衰老模型组比较，有显著性差异(P＜0.05);“＊＊”表示与衰老模型组比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

组别 体重/g脾脏指数/(mg·g-1)肝脏MDA含量/［nmol·(mg 蛋白)-1］脑组织MAO活力/［U·(mg蛋白)-1］正常对照组 39.46±3.33*36.30±4.58 2.78±0.22 23.60±2.03 17.55±1.56 3.06±0.35 24.97±1.35 17.03±1.06衰老模型组 35.46±3.82 2.55±0.28 26.87±1.76 18.93±1.68石油醚组 40.99±3.32＊＊ 3.13±0.23* 11.85±1.83＊＊16.05±1.32*乙酸乙酯组 39.84±1.82* 3.09±0.17 19.20±1.65* 16.30±0.69*正丁醇组 37.07±2.64 2.59±0.36 23.72±1.87 17.90±1.47萃余物组

从表1可见，与正常对照组相比，衰老模型组动物体重明显小于正常对照组，呈显著性差异(P＜0.05)，说明衰老模型组动物生长受到抑制，实验组中石油醚组、乙酸乙酯组与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，表明这2个部分对D-半乳糖衰老模型小鼠的生长有促进作用。石油醚脾脏指数明显高于衰老模型组，有显著性差异(P＜0.05)，而对照组和其他实验组的脾脏指数同样高于模型组，但是差异不显著(P＞0.05)。

在小鼠肝组织MDA含量方面，与衰老模型组比较，石油醚组肝组织MDA水平明显降低，差异极显著(P＜0.01)。乙酸乙酯组能显著降低肝组织MDA水平(P＜0.05)。正丁醇组和萃余物组肝脏MDA水平与模型组相比都没有显著性差异(P＞0.05)，说明油菜蜂花粉乙醇提取物中的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物能明显降低D-半乳糖诱导衰老模型小鼠肝脏MDA水平，提高衰老小鼠的抗氧化力。

在抗小鼠脑组织MAO活力方面，石油醚组和乙酸乙酯组动物脑组织MAO活力与模型组相比明显降低(P＜0.05)，这说明石油醚组和乙酸乙酯组对降低D-半乳糖诱导衰老模型小鼠脑组织MAO活力有明显作用。正丁醇组和萃余物组与模型组相比MAO活力也有一定程度的降低，但是没有显著性(P＞0.05)。

实验结果表明油菜蜂花粉的抗氧化性成分主要集中在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

2.3 油菜蜂花粉中抗氧化性成分结构鉴定

石油醚萃取物经MCI、ODS反相色谱柱反复洗脱分离得到3个主要化合物，其薄层色图如图2。

图2 石油醚萃取物经分离得到的三个主要化合物的薄层色谱图Fig.2 TLC of three main compounds separated from petroleum ether extract

进一步分离纯化得到单体化合物，经1H NMR、13C NMR解析并参照相关文献［12-15］得出，化合物1为α-亚麻酸，化合物2为α-亚麻酸甘油酯，化合物3为3＇-甲氧基-α-亚麻酸甘油酯。化合物2和3是α-亚麻酸衍生物。

从乙酸乙酯萃取物中分离得到3个主要化合物，其单体化合物的薄层色谱图如图3所示。

图3 乙酸乙酯萃取物经分离得到的三个主要化合物的薄层色谱图Fig.3 TLC of three main compounds separated from ethyl acetate extract

化合物经结构解析分别为化合物4:山奈酚-3-O-β-D 吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，化合物5:槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，化合物6:山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。均为黄酮类物质［16］。

3 结论

本研究以油菜蜂花粉90%乙醇提取物依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及萃余物4个部分，经总抗氧化力(T-AOC)、抗小鼠肝组织MDA水平和脑组织MAO活力的测定，得出抗氧化性成分主要集中在石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物中。

经MCI、ODS等反相柱分离纯化得出，石油醚萃取物主要含 α-亚麻酸，α-亚麻酸甘油酯，3＇-甲氧基-α-亚麻酸甘油酯;乙酸乙酯萃取物中主要含有山奈酚-3-O-β-D 吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等成分。

大量文献报道油菜蜂花粉具有很好的抗氧化活性，但大多仅进行体外抗氧化活性评价，没有明确抗氧化活性成分的具体结构。本研究以体内外实验相结合的方法找出油菜蜂花粉中抗氧化性成分，明确其所起的抗氧化作用并通过核磁鉴定出化合物结构。

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