外源NO供体硝普钠（SNP）对盐胁迫下黄连种子萌发及幼苗生理特性的影响

张春平等

摘 要：该研究通过对黄连种子萌发及幼苗生理特性的研究，寻找提高黄连种子及幼苗在盐胁迫条件下抗性能力的途径。采用100mmol·L-1的NaCl模拟盐胁迫，在外源硝普钠（SNP）处理后，对黄连种子的发芽势（Gv）、发芽率（Gr）、发芽指数（Gi）和活力指数（Vi），以及对黄连幼苗叶片细胞质膜透性、O2-.产生速率，H2O2含量，可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸及丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT） 和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性进行测定。结果显示，NaCl胁迫下的黄连种子萌发受到显著抑制，但是在经过不同浓度的SNP处理后，各萌发指标均有升高。实验结果表明，外源SNP处理显著提高了黄连种子的发芽势、发芽率、萌发指数和活力指数，明显提高了盐胁迫下黄连幼苗叶片的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，不同程度的提高了叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，显著降低了叶片丙二醛（MDA）含量、质膜透性、O2-产生速率及H2O2的含量。综上所述，外源SNP通过提高黄连种子的萌发指数，提高渗透调节物质含量及抗氧化酶活性，降低细胞质膜氧化程度，有效地减缓NaCl 胁迫对黄连种子及幼苗产生的伤害，提高了种子及幼苗的抗盐能力。

关键词：黄连；一氧化氮；盐胁迫；种子萌发；生理特性

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）23-10-06

Abstract：In order to get the method of improve the salt resistance of seeds and seedlings for Coptis chinensis Franch.under NaCl stress，seed germination and physiological characteristics of C.chinensis seedlings were studied.Several physiological indexes of C.chinensis seeds and seedlings treated by exogenous nitric oxide donor sodium nitroprusside （SNP） under NaCl stress like the germination vigor，germination rate，germination index and vigor index were measured.And other indexes like the memberane permeability，H2O2 content，production rate of O2-.，the contents of soluble surge，soluble protein，free proline，and malondialdehyde （MDA），the activities of superoxide （SOD），peroxidase （POD），catalase （CAT），and ascorbate peroxidase （APX） were also measured.The germination indexes of C.chinensis seeds under NaCl stress have an obvious inhibition.But after the treatment of SNP，every germination indexes were all increased.The result showed that the treatment of exogenous SNP obviously improve the germination vigor，germination rate，germination index and vigor index，increased the content of soluble sugars，free proline，and soluble protein，decrease the content of malondialdehyde （MDA），H2O2 content，production rate of O2-..Meanwhile，the results also indicated that SNP improve the activities of superoxide （SOD），peroxidase （POD），catalase （CAT），and ascorbate peroxidase （APX）.Exogenous SNP with appropriate concentration could significantly alleviate the damages to the seeds and seedlings of C.chinensis under NaCl stress and promote the salt resistance of the seeds and seedlings through improve the germination indexes and antioxidase activities，decrease the memberane permeability and so on.

Key words：Coptis chinensis Franch.；Nitric oxide；Salt stress；Seed germination；Physiological characteristics

黄连（Coptis chinensis Franch），又名味连、川黄连、鸡爪连，为毛茛科黄连属多年生草本植物，是国家三级保护渐危种[1]。野生黄连大多分布于四川、重庆、湖南、湖北、陕西、贵州等地海拔1 200～1 700m的山谷密林之中。黄连性寒、味苦，根茎入药，具有清热燥湿、泻火解毒等作用[2]，临床上还用于细菌性痢疾、局部化脓性感染、心律失常、胃炎及十二指肠溃疡等的治疗[3]。由于黄连根茎的有效成分小檗碱的独特药效，使得药材市场对其需求量逐年增加。目前，对黄连的研究主要集中在化学成分、药理作用、临床应用及资源保护等方面[4-5]，对黄连栽培过程中的环境胁迫的研究主要集中在热胁迫、冷胁迫、干旱胁迫等方面，而对盐胁迫的报道相对较少，且对外源性物质处理缓解胁迫的报道仅见于极少量文献[6]。

土壤盐渍化是农业栽培生产中的主要障碍之一，目前我国的盐渍土地面积不断扩大，土壤盐渍化制约了药用植物的发展，对农业生产造成了巨大的经济损失。研究表明，NO作为信号分子参与了植物适应逆境的生理调节过程，适当浓度的NO能够提高植物对环境的适应能力。有学者研究认为，NO可缓解盐胁迫对黄瓜造成的伤害，提高其生长量和抗氧化酶活性。但是，NO在药用植物上的研究鲜有报道。本研究基于以上因素，运用NO的外源供体硝普钠对NaCl胁迫下的黄连若干生理生化指标的影响，找到SNP对盐胁迫的缓解调节机制，为黄连在栽培生产中遇到的盐胁迫问题提供理论依据和解决方法。

1 材料与方法

1.1 材料 供试的黄连种子及2a期黄连幼苗均由重庆石柱黄连培育基地提供，经西南大学生命科学学院何平教授鉴定为C.chinensis Franch.的干燥成熟种子。硝普钠（SNP）为上海生工公司生产。

1.2 方法

1.2.1 种子萌发生理指标的测定 挑取籽粒饱满、大小一致的黄连种子，用1.0%的次氯酸钠（NaClO）溶液消毒处理5min，蒸馏水冲洗3～5次，将种子表面水分用滤纸吸干，以铺有双层滤纸和双层纱布的培养皿为发芽床，进行种子发芽试验。胁迫所用的NaCl浓度为100mmol·L-1，实验共设置6个处理：（1）水对照（ck）；（2）100mmol·L-1的NaCl盐处理（S）；（3）100mmol·L-1NaCl+0.01mmol·L-1 SNP（T1）；（4）100mmol·L-1NaCl+0.05mmol·L-1SNP（T2）；（5）100mmol·L-1NaCl+0.10mmol·L-1SNP（T3）；（6）100mmol·L-1 NaCl+0.25mmol·L-1SNP（T4）。黄连种子在培养箱中进行（23±2）/（15±2）℃的变温培养，光照时间设为12/12h（昼/夜），光照强度为2 500lx。每个培养皿100粒种子，4次重复，每天定时统计发芽数，第28天计算发芽势（Gv），第40天计算发芽率（Gr）、发芽指数（Gi）和活力指数（Vi）。计算公式如下：发芽势（Gv）=（28d内发芽的种子数/供试的所有种子数）×100；发芽率（Gr）=（40d内发芽的种子/供试的所有种子数）×100；发芽指数（Gi）=∑（Gt/Dt）；活力指数（Vi）=S×∑（Gt/Dt）。式中，Gt为t日内的发芽数，Dt为相应的发芽天数，S为植株的平均鲜重。

1.2.2 幼苗相关生理指标的测定 选取长势一致的2a期期幼苗移入小花盆中，每盆植入1株，经过10d的缓苗期后，进行盐胁迫试验，共设置以下6个处理：（1）Hoagland营养液空白对照（ck）；（2）Hoagland营养液+100mmol·L-1 NaCl盐处理（S）；（3）Hoagland营养液+100mmol·L-1 NaCl+0.05mmol·L-1SNP（T1）；（4）Hoagland营养液+100mmol·L-1NaCl +0.10mmol·L-1SNP（T2）；（5）Hoagland营养液+100mmol·L-1 NaCl +0.25mmol·L-1SNP（T3）；（6）Hoagland营养液+100mmol·L-1NaCl +0.50mmol·L-1SNP（T4）。每个处理10株幼苗，3次重复，每天定期向花盆内补充Hoagland营养液。分别于盐胁迫后的第5、10和15d进行取样，取样时选取植株中等大小的功能叶片。测量的相关指标包括幼苗叶片质膜透性、质膜氧化程度（丙二醛含量、O2-.产生速率及H2O2含量）、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性。

1.2.2.1 可溶性糖、可溶性蛋白及游离脯氨酸含量的测定 可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均采用张志良[7]的方法进行测量，含量分别以mg·g-1FW、mg·g-1FW和μg·g-1FW来表示。

1.2.2.2 质膜透性的测定 黄连幼苗叶片的原生质膜透性采用电导仪法测定[8]，以相对电导率来表示细胞膜受胁迫伤害的程度。相对电导率（%）=未煮之前的电导率/煮沸后的电导率×100，测量用电导仪型号为LIDA DDS-307W。

1.2.2.3 H2O2含量的测定 采用Lee等[9]的方法进行测定，在436nm下测量吸光度，根据标准曲线计算含量，单位为μmol·g-1FW。

1.2.2.4 O2-.产生速率的测定 采用张志良[10]的方法进行测定，在530nm处的吸光值，单位为μmol·g-1·min-1 FW。

1.2.2.5 丙二醛含量的测定 丙二醛（MDA）含量参照Velikova等[11]的硫代巴比妥酸（TBA）检测法，分别于532nm和600nm处检测吸光度，以μmol·g?1 FW表示丙二醛含量。

1.2.2.6 抗氧化酶活性的测定 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用Xu等[12]的方法，在560nm处检测吸光度，单位为U·mg-1 protein。过氧化物酶（POD）活性的测量方法采用愈创木酚法进行测量[13]，检测波长为465nm，单位为U·mg-1 protein。过氧化氢酶（CAT）活性的测量方法采用Dhindsa等[14]的方法，检测波长为240nm，单位为U·mg-1protein。抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测量方法采用Nakano等[15]的方法，于290nm处检测吸光度，单位为U·mg-1protein。

1.3 数据处理 采用SSPS 12.0统计软件对数据进行方差分析，以Duncans新复级差法比较不同处理间的差异性。

2 结果与分析

2.1 不同处理对盐胁迫下黄连种子萌发的影响 由图1-A，B可以看出，黄连种子在不同的处理下，发芽率和发芽势都有不同程度的变化。与未经任何处理（ck）的发芽势（55.36%）和发芽率（78.49%）相比，可以得出，100mmol·L-1的NaCl处理（S）的种子发芽势（25.17%）和发芽率（39.22%）显著降低，这表明NaCl处理显著抑制了黄连种子的正常萌发。当用不同浓度的SNP处理后，黄连种子的发芽势和发芽率与NaCl处理（S）相比均有不同程度的提高，其中经过0.05mmol·L-1的SNP处理后（T2）的结果最为显著，发芽势和发芽率达到52.74%和79.10%，与其余各SNP处理相比差异显著。图1-C，D所示为发芽指数和活力指数的变化趋势，其趋势与发芽势和发芽率的变化相似。经过NaCl处理后，发芽指数也显著降低，但是经过不同浓度的SNP处理后，发芽指数和活力指数都有明显的升高，并且也是在经过0.05mmol·L-1的SNP处理后结果最为显著，发芽指数（35.70）和活力指数（396.00）达到最大，显著高于盐处理S（16.37和180.39），分别为S处理的2.18和2.19倍，比空白对照（ck）略低，但差异不显著，这说明适宜浓度的SNP可有效缓解盐胁迫对黄连种子萌发造成的伤害，在提高黄连种子各萌发生理指标中具有显著的促进效应。

2.2 不同处理对盐胁迫下黄连幼苗叶片细胞膜脂过氧化及质膜透性的影响 图2所示为盐胁迫下黄连叶片O2-.产生速率及H2O2含量的变化，结果显示，经过NaCl进行胁迫后，两者均有不同程度的升高。在胁迫初期，两者水平与对照组ck相比均显著升高，且随着胁迫时间的延长，提高幅度不断变大；当用外源SNP进行处理后，两者均有不同程度的降低。图2-A所示，SNP在处理初期（5d）对O2-.产生速率的影响表现为：低浓度处理效果并不明显，但是随着浓度的升高，效果越来越明显，在浓度为0.25mmol·L-1时（T3）时降到最小值（1.270μmol·g-1·min-1FW），并且与空白对照ck（1.249μmol·g-1·min-1FW）差异不显著。图2-B所示，在SNP处理初期，H2O2含量及有明显的降低，并且同样在浓度为0.25mmol·L-1时（T3）达到最小值（1.31μmol·g-1FW），甚至低于空白对照ck（1.32μmol·g-1FW），这说明SNP显著地缓解了盐胁迫下黄连叶片H2O2含量升高的趋势。图2-C所示为盐胁迫下丙二醛（MDA）含量的变化，未经任何处理的黄连叶片MDA含量随着时间的延长并无显著变化。而经过NaCl处理后（S）的黄连叶片MDA含量自胁迫初期便呈现出显著升高的趋势，随着胁迫时间的延长，升高的幅度不断增大，在经过SNP处理后，含量均有显著降低，处理前期（T3，5d）达到最低值（0.078μmol·g-1FW）。图2-D所示为盐胁迫下黄连叶片电导率的变化，盐胁迫初期电导率随着胁迫程度和时间的延长而呈现出增大的趋势，并在胁迫后期（15d）达到最大，在经过SNP处理后均有不同程度的降低。以上结果表明，在盐胁迫下，黄连叶片细胞膜透性发生了改变，从而引起部分离子外流，导致电导率发生了变化；而在经过SNP处理后，显著地降低了盐胁迫下黄连叶片的相对电导率水平，保护了叶片细胞，维持了细胞膜的相对稳定性。

2.3 不同处理对盐胁迫下黄连幼苗叶片渗透性调节物质含量的影响 图3所示为盐胁迫不同处理下黄连幼苗叶片渗透物质含量的变化情况，图3-A所示为盐胁迫下黄连幼苗叶片可溶性糖含量的变化趋势，可溶性糖含量与对照ck相比，呈现出升高的趋势，并且差异显著。但是随着NaCl处理时间的延长，可溶性糖含量升高的趋势并不明显。当用外源SNP进行处理后，可溶性糖含量均有不同程度的变化，SNP处理随着时间的延长呈现出持续升高的趋势，并且在处理后期（10d），处理浓度为0.25mmol·L-1时，达到最大值17.10mg·g-1FW，与盐处理S（13.92mg·g-1 FW）形成显著性差异。图4-B所示脯氨酸含量的变化与可溶性糖趋势基本一致，都是在未经处理前含量最低，经过盐胁迫后，含量有所增加。但是经过外源SNP处理后，增加幅度显著提高，使叶片内积累了大量的渗透性物质，以抵抗盐胁迫对叶片造成的伤害。图4-C所示可溶性蛋白在盐胁迫下呈现出先升高后降低的趋势，但是经过SNP处理后，呈现出显著升高的趋势，与盐胁迫处理S相比差异显著，外源SNP有效地减缓了叶片内可溶性蛋白减少的趋势，增加了可溶性蛋白的含量。

2.4 不同处理对盐胁迫下黄连幼苗叶片4种抗氧化酶活性的影响 由图4可以看出，在经过盐胁迫后，4种抗氧化酶的活性都有不同程度的提高，这说明黄连幼苗对胁迫的反应比较比较明显。但是4种酶的具体变化规律并不完全相同，在受到盐胁迫后，随着胁迫时间的推移，SOD和APX呈现出先升后降的趋势，而POD和CAT则呈现出持续上升的趋势。在经过外源处理SNP后，4种抗氧化酶的活性均呈现出显著升高的趋势，并与空白对照ck和盐处理S形成显著差异。并且当SNP浓度达到0.25mmol·L-1时（T3），其效果最好。SOD和CAT的酶活性均在第15d时达到最大值，分别为840.11和9.20U·mg-1protein。POD和APX则是在第10d达到最大值，分别为88.90和1.79U·mg-1protein。这说明，外源SNP显著地提高了4种抗氧化酶的活性，用于减轻细胞氧化程度，维持细胞正常生理活动，并且具有一定的持续作用。

3 结论与讨论

盐胁迫导致细胞膜透性增加，质膜透性可以反映植物细胞膜的破损程度，而MDA是植物细胞膜脂过氧化作用的最终产物，对细胞膜具有毒害作用，是衡量植物细胞膜脂过氧化程度大小的最常用指标。本实验中，NaCl处理造成黄连幼苗叶片质膜透性和MDA含量均高于对照处理，表明盐胁迫能使植物细胞膜脂过氧化作用增强，膜透性增加，加剧植物的氧化损伤。但是当用外源SNP以后，MDA含量显著降低，说明SNP对减缓盐胁迫所造成的伤害具有积极的缓解作用，通过外源物质的处理，有效地降低了H2O2含量及O2-.的产生速率，缓解了二者对细胞膜造成的氧化伤害，从而降低了细胞膜的透性。

SOD、POD、CAT和APX是植物体内酶促防御系统的4个重要保护酶，这些酶类共同作用维持细胞内活性氧代谢的平衡，从而使需氧生物体免受伤害。本研究中，在经过SNP处理后，黄连幼苗叶片中4种抗氧化酶都表现出明显的变化，但是变化趋势略有不同。说明4种酶在遇到胁迫时具有不同的分工，在经过外源SNP处理以后，4种酶的活性大幅度升高以抵抗过氧化对细胞带来的伤害，有效地清除因为膜质过氧化积累下来的活性氧，以实现缓解氧化的目标。本试验结果也证明了外源SNP通过诱导抗氧化酶活性来降低活性氧水平，减轻氧化胁迫对黄连幼苗造成的伤害。Mata等的研究表明[16]，NO缓解干旱胁迫造成的氧化损伤主要是通过NO与活性氧自由基发生反应，从而中断对细胞膜的损伤。外源性NO缓解脂膜过氧化，提高保护酶的活性，可能是由于NO对含铁的相关酶类有很高的亲和性，NO可通过调节CAT等含血红素铁的酶类活性和抑制含非血红素铁的顺乌头酸酶等活性来参与植物抗性生理反应。NO作为信号分子参与了植物适应逆境的生理调节过程，适当浓度的NO能够提高植物对环境的适应能力。樊怀福等[17]认为NO可缓解盐胁迫对黄瓜造成的伤害，提高其生长量和抗氧化酶活性；王罗霞等[18]研究表明低浓度NO对渗透胁迫下小麦叶片膜脂过氧化有明显的缓解效应。

综上所述，SNP通过提高盐胁迫下黄连幼苗的抗氧化酶活性，加强清除活性氧能力，增加膜稳定性，降低细胞渗透势，减少膜质过氧化作用，从而缓解黄连幼苗所受的氧化损伤，增强其抗盐性。

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（责编：张宏民）

综上所述，SNP通过提高盐胁迫下黄连幼苗的抗氧化酶活性，加强清除活性氧能力，增加膜稳定性，降低细胞渗透势，减少膜质过氧化作用，从而缓解黄连幼苗所受的氧化损伤，增强其抗盐性。

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（责编：张宏民）

综上所述，SNP通过提高盐胁迫下黄连幼苗的抗氧化酶活性，加强清除活性氧能力，增加膜稳定性，降低细胞渗透势，减少膜质过氧化作用，从而缓解黄连幼苗所受的氧化损伤，增强其抗盐性。

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（责编：张宏民）