芎䓖汤活血有效部位在大鼠体内整体吸收规律的HPLC指纹图谱研究*

王孝霞，郭小藤，容蓉，杨勇，赵睁睁，2蒋海强，巩丽丽

(1.山东中医药大学药学院，济南 250355；2.寿光市中医医院，山东潍坊 262700)

芎䓖汤出自《千金方》［1］，由川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)和当归［Angelica sinensis (Oliv.)Diels.］两味药等量配伍而成，具有养血补血，活血化瘀的功效，是养荣活血的经典药对［2］，临床上常用于妇女痛经治疗。已知当归的主要成分为阿魏酸，川芎的主要成分为川芎嗪和阿魏酸。单味药及其构成的复方药理作用广泛，如抗脑缺血、抗血小板聚集等作用［3］。由于中药复方组方药物多，单味药成分复杂，其作用的多途径多靶点性，只能对有限的有效成分进行药效学研究，无法反映整体中药体内代谢规律。故本实验研究复方芎䓖汤活血有效部位在大鼠体内的整体吸收规律。指纹图谱技术具有整体性、宏观性、和模糊分析等特点，可以对中药整体化学成分进行良好的表征［4］。

测定给药动物体内多成分代谢的HPLC指纹图谱，能更好地反应多成分在动物体内的吸收变化规律。欧氏距离对于化学指纹图谱的相似性具有较好的综合评价能力［5］。笔者在前期研究工作中，筛选了芎䓖汤的活血有效部位(Blood-activating part of Xiong-qiong decoction，BAP)。该部位能够保护心肌细胞，起到抗心肌缺血的作用，能增加红细胞膜的流动性，改善急性缺血能量代谢障碍的状态，防止心肌进一步坏死［6–7］。采用HPLC指纹图谱技术测定芎䓖汤活血有效部位给药前后大鼠血样，以给药之后血样中多成分整体变化反映药物多成分在血浆中吸收的变化趋势，初步探索芎䓖汤有效部位在大鼠体内的整体吸收规律，为芎䓖汤体内药效学物质基础研究提供实验依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，附带DAD检测器，四元高压梯度泵，柱温箱，美国安捷伦公司；

台式高速离心机：TGL–16G型，上海医用分析仪器厂；

电子天平：Mettler AE240型，瑞士梅特勒公司；

医用超声波清洗器：KQ–500E型，江苏省昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发器：RE–52C型，上海亚荣生化仪器厂；

川 芎(Ligusticum chuanxiong Hort)，当 归[Angellica sinensis (Oliv)Diels.]：批 号20100911，20100821，经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为经加工的规范饮片，济南市建联药店；

大孔吸附树脂：D101型，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；

乙腈：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

实验用水为纯净水；

实验所用其它试剂均为分析纯。

1.2 实验动物

SD大 鼠，雌雄兼用，体 重280～300 g。山东中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(鲁)2011–0002。

1.3 芎䓖汤活血有效部位灌胃溶液的配制

称取过0.425 mm(40目)筛的当归、川芎粉末各250 g，加12倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，回收乙醇，浓缩至1 000 mL，制得芎䓖汤醇提液［8］(每毫升溶液相当于0.5 g生药材)。取900 mL芎䓖汤醇提液，以1∶3的比例(药材质量与树脂体积比)过D101大孔树脂柱［9］，分别用10倍量的水，20%，40%，60%，95%的乙醇依次洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，分别浓缩至450 mL，制得芎䓖汤大孔吸附树脂20%，40%，60%，95%乙醇洗脱部位样品溶液(每毫升样品溶液相当于1 g生药材)。据课题组前期研究发现，芎䓖汤活血有效部位主要集中在40%乙醇洗脱部位［6–7］，将其编号为EE40部位。将EE40部位浓缩至40 mL，加3 g吐温–80，混匀后用蒸馏水定容至100 mL，供大鼠口服给药，按《人和动物体表面积折算等效剂量比值表》计算相当于人临床等效剂量的5倍为大鼠灌胃剂量，给药量为18.5 mL／kg。

1.4 大鼠含药血浆及空白血浆的制备

SD大鼠，禁食(不禁水)12 h，按18.5 mL／kg体重的容量灌胃EE40 部位。给药后10，15，30，45，90，150，240，300，360 min从大鼠眼底静脉丛分别采血0.5 mL，以肝素抗凝，3 000 r／min离心10 min，分取血浆0.3 mL，加入3倍量甲醇，10 000 r／min离心10 min，取上清液1 mL，25℃氮气流吹干，残余物用100 μL甲醇复溶，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取10 μL进样分析。在灌胃前先行取空白血0.5 mL，同法处理，作为空白对照。

1.5 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB–C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司)；流动相：A为乙腈，B为0.085%磷酸水溶液，梯度洗脱条件见表1；流速：1.0 mL／min；检测波长：292 nm，参比波长360 nm；柱温：35℃；进样量：10 μL。

表1 EE40部位含药血浆HPLC指纹图谱流动相条件

2 结果与讨论

2.1 稳定性及精密度试验

取给药后45 min时间点采集的血样，按照1.4方法处理，按1.5色谱条件进样测定，每隔2 h进样一次，10 h内连续进样5次，同时考察精密度和样品10 h内的稳定性。以6号峰为参比峰，各特征峰保留时间和特征峰面积为指标进行考察，结果见表2(特征峰编号见图2)。

表2 EE40部位含药血浆指纹图谱特征峰稳定性及精密度试验结果

续表2

由表2可知，各特征峰相对保留时间的相对标准偏差为0.18%～0.91%，各特征峰相对峰面积的相对标准偏差为0%～2.15%，表明HPLC指纹图谱测定精密度良好，样品在10 h内稳定。

2.2 大鼠血样HPLC指纹图谱的测定

将1.3中灌胃溶液及EE40部位给药前后不同时间点的大鼠血浆，按1.5色谱条件进行测定。相关样品色谱图见图1～图3。

图1 空白血浆HPLC指纹图谱

图2 EE40部位给药后10 min血浆HPLC指纹图谱

图3 EE40部位HPLC指纹图谱

2.3 HPLC指纹图谱数据

以色谱峰保留时间和光谱特征为定性指标，通过与空白血浆HPLC指纹图谱比较，提取给药后血浆的HPLC指纹图谱中峰面积有明显变化的色谱峰和新增的色谱峰作为特征峰（特征峰编号见图2），采集特征峰峰面积，结果见表3。

表3 EE40部位给药后血浆HPLC特征峰峰面积(n=3)

2.4 HPLC指纹图谱数据分析

2.4.1 类间相似性计算原理

对于n个含m个指标的样本，可以定义为m维空间的点：在m维空间的任意两点，其相似性可用“距离”度量，定义为“dij”，若将任意样本看作一类，其类间相似性可用欧式距离DE表示［10］。欧式距离越大，其类间相似性越差。

按式(1)计算给药前后不同时间点收集的血样HPLC指纹图谱的欧氏距离DE，表征各样本指纹图谱间的相似性，考察样本中多成分的总体变化趋势。

式中：l—样本指标数，即特征峰个数l=1，2，3…m；

i，j——样本序号，即不同时间段采集的样本；

xil，xjl——样本各指标，即特征峰面积。

2.4.2 欧氏距离的计算

将给药后样品作为i样本、给药前样品作为j样本，以HPLC特征峰面积为指标，计算给药前不同时间点收集的血浆HPLC指纹图谱特征峰与给药后不同时间点收集的血浆HPLC指纹图谱特征峰的欧氏距离DE，结果见表4。以欧氏距离DE为纵坐标、给药后的取样时间为横坐标绘图，结果见图4。

表4 EE40部位大鼠含药血浆与空白血浆的欧氏距离DE

图4 EE40部位给药后血样HPLC指纹图谱特征峰欧氏距离变化

由图4可知，EE40部位大鼠给药后血浆整体成分在45 min时变化达到最高值，1.5 h之内变化显著，随后变化较小。提示该复方药对EE40部位在45 mim吸收达到极值，1.5 h内药物在机体内的总体血药浓度保持在较高水平。该研究解释了活血有效部位动物体内的整体吸收趋势，为今后临床合理用药提供依据［11］。

3 结论

中药复方具有多成分协同作用的特点，以HPLC指纹图谱研究芎䓖汤提取物大鼠给药前后血浆成分随时间的变化信息，可以较全面地反映复方药物在体内的吸收情况。对于指纹图谱的数据处理，采用欧氏距离计算指纹图谱中多个特征值的变化，可以全面、客观地度量图谱间的差异，从整体上反映给药前后血样指纹图谱的变化。因此利用该方法研究复方中药在体内的吸收过程，符合中药整体作用的特点，为阐述中药复方的整体作用机制提供方法学基础，为进一步研究复方中药体内的代谢规律提供依据。

实验中以色谱峰保留时间和峰面积为指标，通过与空白血浆样品指纹图谱比较，发现给药后血浆样品的HPLC指纹图谱的部分色谱峰与给药前样品相同，属内源性成分；新增色谱峰为增加的成分，可能来自芎䓖汤EE40部位原成分及其代谢产物。这些成分的结构确定有待于进一步研究。

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