臭菘根部分离的一种酪氨酸酶抑制剂的研究

毛欣欣+张智文+李长田

摘要：目的：对臭菘根部中分离的一种化学成分的酪氨酸酶抑制活性进行研究。方法：利用色谱柱分离纯化再根据理化性质和波谱技术对化合物进行结果鉴定，采用酶动力学方面对臭菘根部分离得到的化合物3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸其酪氨酸酶抑制研究。结果：从臭菘植物根部的甲醇部分分离的化合物3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸，对单酚酶（IC50=0.4毫摩尔/升）和二酚酶（IC50=0.25毫摩尔/升）都具有抑制作用。结论：从臭菘植物根部首次分离得到的化合物3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸为酪氨酸酶的竞争型可逆性抑制剂，抑制常数（KI）为3.0997 毫摩尔/升。

关键词：臭菘;酪氨酸酶;抑制作用;动力学;3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸

中图分类号：TQ464.8                                文献标识码：  A                               DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.24.0017

臭菘为天南星科（Araceae）臭菘属（Symplocarpus）多年生宿根草本植物，分布于东西伯利亚鄂霍茨克、中国东北部、北美东部、朝鲜半岛和日本，在中国主要分布于吉林省、黑龙江和乌苏里江流域以及松花江流域[1-4]。

臭菘生长于海拔300米以下地区，常生于湿草甸、沼泽或沼泽落叶林中、潮湿针叶林及混交林下，河渠的水流中也有生长。据《中华本草》记载在药理方面臭菘的根煎剂具有镇静、解痉和祛痰作用，解表止咳，化痰平喘，主治发烧头痛、气管炎咳喘等。臭菘叶主治风湿痹痛，有祛风除湿的功效。臭菘种子亦有镇咳、祛痰、平喘、强心的药效，主治气管炎咳喘[5]。目前对臭菘的化学成分及其活性的研究报道很少，本实验从臭菘根部的甲醇部分得到1个化合物，经波谱分析，鉴定其为3' 5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸（为该植物首次分离得到），由于其是肉桂酸类衍生物亦为羧基化合物，据文献报道此类化合物有对酪氨酸酶的抑制作用[6-8]，而作为酪氨酸酶的抑制剂，可作于防止食品褐变的添加剂、化妆品美白的功能成分以及农业害虫的调节剂等[9，10]。本文从酶动力学角度分析了3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸的酪氨酸酶抑制活性，为臭菘植物作为天然产物的开发与利用提供参考。

1 实验方法

1.1 仪器与材料

Varian Inova500型核磁共振仪，LCQ型质谱仪，ZF-1型三用紫外分析仪，凝胶Sephadex LH-20，RE-52AA旋转蒸发仪，TU-1810紫外分光光度计，GB204电子分析天平，GF254硅胶板、柱层析用硅胶均为青岛海洋化工厂所产，L-酪氨酸（L-Tyrosine）、左旋多巴（L-DOPA）、酪氨酸酶均为SIGMA公司产品，其他药品、试剂均为分析纯。

臭菘[Symplocarpus foetidus （Linn.） Salisb.]采于吉林省临江市老三队地区（N：41.56.596°、41.94452°E：126.81072°、126.8019°H：370m、573m正西坡）。经吉林农业大学园艺学院胡全德教授和中药材学院李长田副教授鉴定，所采植物样品为臭菘属（Symplocarpus）臭菘（S. foetidus）植物。

1.2 提取与分离

将臭菘晾干，取干根2公斤，用95%工业酒精60℃回流提取3次，合并提取液，解压浓缩至浸膏无溶剂味，加水悬浮，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯各萃取3次，将萃取后的剩余部分用硅胶色谱柱、氯仿—甲醇系统进行梯度洗脱，又经凝胶纯化和重结晶等分离手段得193.23毫克白色晶体化合物。

1.3 结构鉴定

化合物为白色结晶（甲醇），1H NMR （300 MHz， DMSO）δ 12.29（s，1H）， 7.51（d，J = 15.9 Hz，1H），7.03（s， 2H），6.53（d，J = 15.9 Hz，1H），5.03（d，J = 7.4 Hz，3H）， 4.95（d，J = 17.3 Hz，2H），4.43（d，J = 25.4 Hz，1H），4.31（t， J = 5.3 Hz，1H），3.62 - 3.50（m，1H），3.40（dd，J = 11.4， 5.7 Hz，2H），3.19（s，2H），3.10（dd，J = 25.3，8.7 Hz，3H）。

13C NMR（101 MHz，DMSO）δ 167.55（C-1），118.36（C-2），143.87（C-3），129.59（C-1'），106.65（C-2'，C-6'）， 152.68（C-3'，C-5'），136.23（C-4'），102.23（C-1''），77.20（C-5''），76.55（C-3''），74.13（C-2''），69.91（C-4''），60.84（C-6''），56.45（C-OCH3×2），以上波谱数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定此化合物为3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸。

1.4 化合物对酪氨酸酶的抑制测定

以1.2中分离得到的3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸（以下称为抑制剂）作为待测样品，测定其对酪氨酸酶的抑制作用。

酪氨酸酶的单酚酶活性测定： 将测单酚酶酶活力所用底物L-Tyrosine置于恒温水浴锅中30℃水浴10分钟后，向各比色皿中加入2.8毫升，继而取配好的不同浓度（抑制剂浓度分别为0.75、0.5、0.4、0.3 和0.2毫摩尔/升）的待测抑制剂各0.1毫升于各比色皿中，对照皿中加入不含抑制剂的DMSO 0.1毫升，最后分别加入酪氨酸酶溶液0.1毫升（酪氨酸酶终浓度为13.37微克/毫升）快速混匀，紫外分光光度计475纳米波长下测定吸光度（测定时温度保持在30℃），每分钟读取记录一次数据，连续测7分钟。

酪氨酸酶的二酚酶活性测定：测定二酚酶活力方法同上所述，但所用底物L-DOPA缓冲液，酪氨酸酶终浓度为6.67毫克/毫升。

抑制剂对酪氨酸酶的抑制可逆性测定：在测定活力的体系中，L-DOPA为固定底物，其浓度为0.5毫摩尔/升，向各比色皿中加入不同浓度的抑制剂（0.5、0.3、0.1和0.05毫摩尔/升），并改变所加入酶的浓度（1.66、2.66、4.44、6.66、8.88和13.37毫摩尔/升），测吸光度。

抑制剂对酪氨酸酶二酚酶活性抑制类型及抑制常数测定：将不同浓度的抑制剂（0.75、0.4、0.2和0.05毫摩尔/升）以及不含抑制剂的等体积DMSO加入含有不同浓度L-DOPA底物（0.5、0.25、0.33、0.66和1.0毫摩尔/升）的测酶活体系中，测吸光度。

2 结果与分析

如图1所示，不同浓度的抑制剂对酪氨酸酶氧化L-Tyr的抑制效果，由图1a中（曲线1）的发展走势可以看到不含抑制剂的体系中L-Tyr的氧化有明显延滞期。图1a中2～7曲线显示了所含不同浓度抑制剂（浓度从低到高）体系中的酪氨酸氧化的反应过程，结合图1b中所示的含不同浓度抑制剂各体系的反应延滞时间和图1c中显示的稳态期不同抑制剂对稳态期酶活力的抑制情况，延滞时间不会随着抑制剂浓度的增加而有所变化，而稳态期系统中酶活力随着抑制剂浓度的增加呈减低趋势。浓度为0.75毫摩尔/升的抑制剂系统中的剩余酶活为30%，抑制剂浓度为0.2毫摩尔/升的系统中的为72%。抑制剂的半抑制浓度（IC50）为0.4毫摩尔/升。

b

图1 化合物对单酚酶的抑制作用

（a）酪氨酸酶促反应酪氨酸氧化的发展曲线，1～6化合物浓度依次为：0、0.2、0.3、0.4、0.5和0.75毫摩尔/升;（b）化合物对延滞时间的影响;（c）化合物对单酚酶稳态活力的影响。

抑制剂抑制酪氨酸酶对L-DOPA的氧化活性，即对二酚酶的抑制效果试验，是用L-DOPA作为酪氨酸酶的底物的，二酚酶的反应会立即达到稳态期（没有延滞时间）。由图2中所示的结果可以看出，酪氨酸酶二酚酶的活力随着抑制剂的剂量增加而减弱，且在0.4毫米以内的抑制剂浓度有较为显著的降低，降幅可达62%，而在抑制剂浓度为0.4～0.75 毫摩尔/升的范围内下降较缓，降幅为12.4%。估算出导致剩余酶活力失去50%的抑制剂浓度（IC50）为0.25毫摩尔/升。

（a）酪氨酸酶促反应L-DOPA变化的发展曲线，1～6化合物浓度依次为：0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75毫摩尔/升;（b）化合物对二酚酶稳态活力的影响。

从L-DOPA氧化的被抑制情况，来研究抑制剂对酪氨酸二酚酶的抑制机制。图3所示，在含有抑制剂的系统中酶活力与酶浓度的关系，由于作用的抑制剂浓度的不同，在图中给出了酶活力对酶浓度的一组全部通过原点的直线，抑制剂浓度的增加使得直线的斜率呈现下降的结果，表明抑制剂的存在不会使酶在总量上有所减少，而仅仅是减弱了酶的活力。

图3 化合物对酪氨酸酶二酚酶的抑制机理，1～5化合物浓度分别为0、0.05、0.1、0.3、0.5毫摩尔/升

对L-DOPA氧化过程中的酪氨酸酶动力行为进行了研究。在本次研究中，酪氨酸酶参与催化的L-DOPA氧化反应遵循着米氏动力学。改变含有不同浓度抑制剂各体系中的反应底物L-DOPA的浓度，并测定各体系中L-DOPA氧化反应的初速度。含抑制剂体系中酪氨酸酶的动态研究如图4所示的以Lineweaver-Burk双倒数作图，得到一组相同截距，且相交于纵坐标轴（1/V），斜率不同的直线。由这种只使米氏常数（Km）增大，却不会影响最大反应速率（Vm）的情况，可以判断该抑制剂对酪氨酸酶为竞争性抑制。出现这种竞争类型一般认为是由于抑制剂与酶反应底物具有相类似的结构，其会与底物竞争酶活性中心的结合位点。竞争性抑制剂只能与游离酶（E）相结合，以与底物争夺酶结合部位的方式，使酶活力呈现下降的结果，并不能酶—底物的复合物（ES）结合，底物量的增加会减少其与酶的几率，而使它与酶结合产生的这种抑制作用减弱，直至消失。以图4中各浓度抑制剂对应的直线结合米氏方程计算出米氏常数（Km），以Km对抑制剂浓度作图（图4b），获得一条斜率为3.0997的直线，进而可知该抑制剂与酶结合时的平衡常数，即抑制常数（KI）为3.0997毫摩尔/升。

（a） Lineweaver-Burk双倒数作图，直线1～5化合物浓度分别为0、0.05、0.2、0.4和0.75 毫摩尔/升。

（b） 直线的斜率对抑制剂浓度作图

3 讨论

酪氨酸酶以三种形式存在，氧化态（Eoxy）酪氨酸酶可以单酚或二酚结合与底物作用成为脱氧态（Emet）酶同时生成水和醌，脱氧态酶再与氧结合成为氧化态酶，而进入循环，还原态酶（Edeoxy）则仅仅可以结合二酚却不具有单酚酶活性。酪氨酸酶同时具有单酚酶活性和二酚酶活性，就是由于此三种形式酶的存在与转化而表现出来的。本试验从臭菘植物中所提取的3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸是肉桂酸类衍生物亦为羧基化合物，同时具有抑制单酚酶和二酚酶活力的功能，且其所表现出的抑制活性为竞争性抑制。试验结果表明3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸对酪氨酸酶促反应的延滞时间几乎没有影响，对二酚酶的抑制作用要好于对单酚酶的作用。该抑制剂浓度为0.75 毫摩尔/升时，单酚酶的剩余酶活为30%，而二酚酶的剩余酶活为25.6%。两者的半抑制浓度（IC50）分别为0.4和0.25毫摩尔/升。文献对肉桂酸及其衍生物对酪氨酸酶的抑制报道的不少，石艳、陈清西[12]等人研究了肉桂酸及其3个衍生物（2-羟基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸）对酪氨酸酶的抑制，研究发现，除2-羟基肉桂酸外，其余三者对二酚酶都有不同程度的抑制。龚盛昭等人对肉桂酸、对羟基肉桂酸以及肉桂酸甲酯抑制酪氨酸酶催化反应的动力学研究中测得肉桂酸和肉桂酸甲酯均为为非竞争性抑制剂，肉桂酸对单酚酶和二酚酶抑制的IC50分别为0.37和0.61毫摩尔/升，抑制常数（KI）为0.68毫摩尔/升，肉桂酸甲酯抑制单酚酶和二酚酶的IC50为0.61和1.49 毫摩尔/升，其抑制常数为0.66毫摩尔/升，而对羟基肉桂酸对酪氨酸酶的抑制类型为混合型的，其单酚酶和二酚酶的IC50为0.12和0.50毫摩尔/升，对游离酶（E）和酶—底物络合物（ES）的抑制常数分别为0.29和0.60毫摩尔/升[13-15]。

本研究中的抑制剂的IC50较上述的肉桂酸及其衍生物的都要低，且比熊果苷的（IC50=5.3毫摩尔/升）也要低很多，可被利用于酪氨酸酶抑制剂中，若将其产品化，还需对其进行更深入的研究。

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[15] 龚盛昭，邓相庆，李仕梅.对羟基肉桂酸抑制酪氨酸酶活性的动力学研究[J].日用化学工业，2006，36（3）：159-162.

作者简介：毛欣欣，硕士，吉林农业大学中药材学院，教师，研究方向：野生动植物保护与利用。

通讯作者：张智文，硕士，吉林农业大学中药材学院，教师，研究方向：天然药物化学。

本研究中的抑制剂的IC50较上述的肉桂酸及其衍生物的都要低，且比熊果苷的（IC50=5.3毫摩尔/升）也要低很多，可被利用于酪氨酸酶抑制剂中，若将其产品化，还需对其进行更深入的研究。

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作者简介：毛欣欣，硕士，吉林农业大学中药材学院，教师，研究方向：野生动植物保护与利用。

通讯作者：张智文，硕士，吉林农业大学中药材学院，教师，研究方向：天然药物化学。

本研究中的抑制剂的IC50较上述的肉桂酸及其衍生物的都要低，且比熊果苷的（IC50=5.3毫摩尔/升）也要低很多，可被利用于酪氨酸酶抑制剂中，若将其产品化，还需对其进行更深入的研究。

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作者简介：毛欣欣，硕士，吉林农业大学中药材学院，教师，研究方向：野生动植物保护与利用。

通讯作者：张智文，硕士，吉林农业大学中药材学院，教师，研究方向：天然药物化学。