β-葡聚糖酶产生菌的分离、筛选及鉴定

王 伟，王世英，郭晓军，李 佳，朱宝成

（河北农业大学生命科学学院，河北保定071000）

β-葡聚糖作为植物细胞壁的结构性非淀粉多糖，广泛存在于燕麦、大麦、黑麦、小麦等麦类作物中。常见麦类作物中，燕麦和大麦β-葡聚糖含量较高，其中燕麦含量最高。β-葡聚糖是限制麦类有效利用的主要因素，因此常使用β-葡聚糖酶来有效分解麦类植物胚乳细胞壁中的β-葡聚糖，以降低饲料中非淀粉多糖（NSP）及其抗营养因子的含量，从而提高饲料的消化率，促进禽畜的生长（刘雨田等，2000）。 翟晓莉（2012）研究表明，在大麦型猪饲粮中添加β-葡聚糖酶，会使日增重提高5%～45%，饲料报酬率提高3%～15%。李春燕等（2012）在肉鸡饲料中分别添加0.1%和0.2%的β-葡聚糖酶，结果发现肉鸡日增重提高了10.45%和15.31%，料肉比降低了9.64%和10.84%，差异均显著。

本研究利用刚果红平板法作为筛选模型，从动物粪便中分离和筛选高产β-葡聚糖酶的菌株，并对其进行形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析及系统发育分析，从而对其进行鉴定，为今后该菌株在畜牧生产中的应用提供良好基础。

1 材料

1.1 供试样品 动物粪便，取自河北农业大学动物标本园。

1.2 培养基 NA培养基、NB培养基的配制详见《微生物学实验技术》（程丽娟和薛泉宏，2000）。

分离和初筛培养基：β-葡聚糖 0.1 g，刚果红0.04 g，蛋白胨 1.0 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.01 g，CaCl20.04 g，琼脂 1.5 ～ 2.0 g，蒸馏水 100 mL，pH 7.0，121℃灭菌 20 min。

发酵产酶培养基：β-葡聚糖0.1 g，蛋白胨1.0 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.01 g，CaCl20.04 g， 蒸馏水100 mL，pH 7.0，121 ℃灭菌 20 min。

1.3 生理生化鉴定 生理生化鉴定试剂参见《常见细菌系统鉴定手册》东秀珠和蔡妙英（2001）。

1.4 DNA提取和16s rDNA基因扩增所用试剂TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；1 mmoL EDTA （pH 8.0）；SDS 提 取 缓 冲 液 ：100 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）；20 mmol/L EDTA；10%SDS；1.4 mol/L NaCl；Tris 饱和酚+氯仿 （25∶24，V/V）；50 mg/mL溶菌酶溶液；1mg/mL RNase A；1%琼脂糖 凝 胶 ；70 ng/μL DNA 模 板 ；2.5 mmol/L dNTP Mixture；10×ExTaq Buffer （Mg2+pluse ）；20 μmol/L 27F；20 μmol/L 1495F；ExTaq DNA 聚合酶。

2 方法

2.1 样品的采集和处理 选取新鲜兔子的粪便约150 g，装入灭菌后的塑料袋内。4℃冰箱中保存。

2.2 分离和初筛 称取兔子粪便10 g，放入含90 mL无菌水和十几粒玻璃珠的250 mL三角瓶中，摇床200 r/min旋转摇动10 min，使成均匀的10-1g/mL菌悬液，置80℃水浴20 min，然后进行10 倍梯度稀释。选取 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等稀释梯度，涂布在初筛培养基平板上，置于37℃培养箱中培养，2～5 d后观察并挑取能够在初筛培养基平板形成透明圈的菌落，在NA培养基平板上划线纯化后，连续重复3次点接在初筛培养基平板上，37℃培养48 h，挑取透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落，37℃培养1～2 d后4℃保存备用。

2.3 β-葡聚糖酶活力测定 配制液体发酵产酶培养基，调节pH至7.0，分别倒入250 mL三角瓶，装液量为50 mL，分别接入初筛得到的具有较大水解圈的菌株，37℃条件下220 r/min旋转摇床培养48 h，发酵液经4℃、10000 r/min离心5 min，取清液，备用。

2.3.1 测定原理 β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。

在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为4 mg/mL的β-葡聚糖溶液中降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。

2.3.2 测定方法 β-葡聚糖酶活力采用分光光度法测定（NY/T 911-2004）。以菌株产β-葡聚糖酶活力的高低作为评价指标，筛选酶活力较高的菌株作为微生物发酵消除谷物中抗营养因子的供试菌株。

2.4 菌种鉴定

2.4.1 形态鉴定 菌落形态观察：挑取少量NA斜面上30℃培养24 h的T-4-3菌株至装有10 mL无菌水的试管中，充分混匀后取1 mL至装有9 mL无菌水的试管中，依次稀释得到不同浓度的菌悬液。分别取10-4、10-5稀释梯度的稀释液0.1 mL涂布NA培养基平板，然后倒置于30℃培养箱中培养24 h，观察菌落形态。

菌体形态观察：挑取NA斜面上30℃培养24 h的T-4-3菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）的方法进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态。

2.4.2 生理生化鉴定 参照 《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）的方法对T-4-3菌株分别进行接触酶，V.P测定，淀粉水解，硝酸盐还原，亚硝酸盐还原，柠檬酸盐利用，明胶液化，甲基红试验，纤维素分解，酪素水解，吲哚试验，丙二酸盐利用，耐盐性试验，糖、醇类发酵，生长温度等生理生化试验。

2.4.3 DNA提取和16S rDNA基因扩增 参考Kim 等（1995）和 Rainey 等（1996）的方法提取细菌总DNA。取对数生长期的待鉴定菌株的发酵液1.5 mL，8000 r/min 离心去菌体。悬于 400 μL TE 缓冲液，加入50 mg/mL的溶菌酶溶液20 μL，37℃过夜温育。加入400 μL SDS提取缓冲液，65℃温育45 min，冷却至室温，加入400 μL的Tris饱和酚+氯仿（25∶24，V/V），混匀后 12000 r/min 离心 10 min，上相用等体积的氯仿抽提，混匀后12000 r/min离心，10 min后上相用1倍体积冰冷的异丙醇沉淀DNA，-20℃静置30 min，室温干燥后溶于200 μL TE 缓冲液，加入 20 μL RNAase（1 mg/mL），37℃，30 min。室温干燥后溶于30 μL TE缓冲液，1%琼脂糖电泳检测DNA质量，估计提取的DNA浓度。

引物为通用引物 （Lane，1991）， 正向引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。 反向引物为 1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。分别位于16S rDNA的8～27和1495～1514位的碱基片段 （以Escherichia coli的16S rDNA碱基位置为准）。

PCR 反应体系：DNA（70 ng/μL）模板 2 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1495F （20 μmol/L）1.5 μL；10 ×ExTaq Buffer （Mg2+pluse）5 μL；ExTaq DNA 聚合酶 0.2 μL；补足 ddH2O 至 50 μL。

PCR条件为：94℃预变性3 min；然后94℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72℃延伸 3 min，共30个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物经试剂盒纯化后测序。

2.4.4 16S rDNA序列分析及系统发育树绘制将所测得的16S rDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性分析，并与GenBank中的相近序列在Clustal X（1.8）程序包中进行多重序列匹配排列（Multiple alignments）分析，最后形成一个多重序列匹配排列阵，其中形成的缺口用“-”填补，用Neighbor-Joining法构建系统发育树（Saitou 和 Nei，1987）。

3 结果与分析

3.1 初筛 本试验以是否能水解β-葡聚糖从而在刚果红平板上产生水解圈来判定是否为产β-葡聚糖酶菌株，共筛选出菌株28株，水解圈直径与菌落直径比在2.0以上的菌株有16株，5.0以上的菌株有4株，分别是T-4-2、T-4-3、D-5-1、L-3-9，其中D-5-1的直径比最高，达到13.09，如表1所示。

表1 初筛所得菌株的直径

3.2 β-葡聚糖酶活力测定 将初筛所得菌株在液体发酵产酶培养基中进行发酵培养。采用DNS法定量测定发酵后上清液的酶活力。其中酶活力在4.0 U/mL以上的有14株，结果如表2所示，其中 T-4-3菌株酶活力最高，达到21.9 U/mL。

表2 菌株产酶活力 U/mL

3.3 菌株T-4-3的鉴定

3.3.1 菌落形态 菌株在NA平板上生长，单菌落呈近圆形，边缘整齐，中央隆起，不透明，近白色，表面光滑。

3.3.2 菌体形态 在NA试管斜面上培养24 h的菌体进行革兰氏染色，在油镜下观察，革兰氏阳性，芽孢呈椭圆形中生，菌体具抗酸性，可产生异染粒，菌体生长物向四周呈云雾状扩散。

3.3.3 生理生化试验结果 按 《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）中的方法进行生理生化试验，结果见表3。

表3 T-4-3菌株的生理生化特征

综合以上T-4-3菌株的形态特征和生理生化特性，对照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》进行检索，初步将其鉴定为芽孢杆菌属。

3.3.4 T-4-3菌株的系统发育分析 为进一步确定T-4-3菌株的分类学地位，需测定其16S rDNA基因序列。经测定，T-4-3菌株序列长度为1448 bp。将T-4-3菌株的16S rDNA基因序列在GenBank中进行Blast相似性分析，并将Genbank中与T-4-3菌株相似性较高的7个菌株构建系统进化树。结果如图1和表4所示，供试菌株的16S rDNA序列与芽孢杆菌属的标准菌株同源相似度大部分在99%以上；T-4-3菌株与CP000560 Bacillus amyloliquefaciens和AY603658 Bacillus velezensis序列相似性高达100%。综合以上T-4-3菌株的形态特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列的分析结果，鉴定T-4-3菌株为Bacillus amyloliquefaciens。

图1 T-4-3菌株的16S rDNA序列系统发育树

表4 T-4-3菌株与几种标准菌株的相似性比较

4 结论

本试验采用刚果红平板法初筛和摇瓶复筛相结合的方法从动物粪便中分离和筛选到一株β-葡聚糖酶活力较高的菌株T-4-3，酶活力达到21.9U/mL。对该菌株进行形态观察、生理生化特征分析，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），将其16S rDNA序列与GeneBank中已知标准菌株的16S rDNA序列进行比对，并用Neighbor-joining方法构建菌株T-4-3进化树，结果表明，T-4-3与标准菌株CP000560 Bacillus amyloliquefaciens聚于同一分支，同源性高达100%。

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