榆干离褶伞发酵液对血管内皮细胞的保护作用

彭 瀛， 周广亮， 沈明花

（延边大学 医学院，吉林 延吉 133000）

血管内皮细胞不仅作为血液与血管平滑肌之间的机械屏障，而且又是机体最大的内分泌器官[1]，在调节血管紧张度、抗血小板聚集以及抗凝促纤溶等过程中起着重要的作用，其抗栓作用越来越受到重视。血栓是血液中纤维蛋白多聚体与细胞组成的复合物，其形成与诸多因素有关，其中，血管内皮细胞的损伤与血栓形成密切相关。血管内皮细胞的过度凋亡是血栓形成的重要原因。

榆干离褶伞（Lyophyllum ulmarium），又名大榆蘑。属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、离褶伞属。据文献报道，其发酵液具有抗氧化[2]、溶栓[3]作用。作者主要探讨榆干离褶伞发酵液对血管内皮细胞的保护作用，为榆干离褶伞的溶栓机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品的制备 榆干离褶伞菌种：由韩国益山大学特种作物加工实验室提供。在25℃、150 r/min液体深层二级培养15 d。将发酵液用纱布过滤，收集滤液以3 000 r/min离心15 min，将上清液进行冷冻干燥，得样品。

1.1.2 细胞株 人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）： 购自北京宏宝达生物科技有限公司

1.1.3 试剂 MTT和DMSO：Sigma公司；Annexin-V-Fluos试剂盒：美国Roche公司；DMEM培养基：Gibco公司；胎牛血清和胰酶：华美生物工程公司；兔抗 bcl-2、bax、Caspase-3 和 Caspase-9 抗体：美国Santa Cruz公司；LDH试剂盒：南京建成生物技术有限公司。

1.2 仪器

倒置显微镜：日本日立公司；酶标仪：日本岛津公司；流式细胞仪：Beckman公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将HUVEC在37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。待细胞长满至80%时更换为无血清培养基，做以下实验并进行相应指标的测定。

1.3.2 MTT法检测LU发酵液的细胞毒性作用 取对数生长期的细胞，将细胞密度调整为5×104/L，接种于96孔培养板，每孔200 μL。待细胞贴壁后，分4组，分别为空白对照组、低、中、高剂量LU发酵液用药组，每组设6个复孔。用药组分别加入终质量浓度为20、40、80 mg/L的LU发酵液，而空白对照组加相应体积的培养基。各组分别培养24、48 h后每孔加入预先配制的MTT液20 μL，37℃继续孵育4 h。吸去每孔培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡5 min后，在波长490 nm处测定各孔光吸收值（A），按下列公式计算细胞存活率：

1.3.3 LU发酵液对H2O2所致损伤细胞存活率的影响 取前述传代细胞接种到96孔板中，分为正常对照组、模型组和发酵液低（20 mg/L）、中（40 mg/L）、高（80 mg/L）剂量用药组，每组设6个复孔。首先用药组以低、中、高剂量发酵液预处理细胞24 h，正常对照组和模型组以无血清培养基代替。24 h后，除正常对照组外其余各组均加入终浓度为200 μmol/L的H2O2，继续培养4 h后按方法1.3.2进行MTT检测。

1.3.4 细胞上清液LDH的测定 收集各组上清液以测LDH活性。

1.3.5 流式细胞术测定细胞凋亡率 将细胞接种于6孔板，分组及处理同1.3.3。培养24 h后，用胰酶消化并收集细胞，用PBS冲洗两次，调整细胞数1×106个。按美国Roche公司提供的试剂盒说明书操作，进行流式细胞仪凋亡检测。

1.3.6 Western Blot法检测 Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3蛋白质的表达 分组及处理方法同1.3.3。分别收集各组细胞，提取总蛋白，参照文献[4]方法进行电泳、转膜、显影及定影。

1.4 统计学分析

用SPSS统计软件处理，进行单因素方差分析，数据用x¯±s表示。

2 结果与分析

2.1 LU发酵液对正常血管内皮细胞的影响

与正常组相比，中、高剂量组处理HUVEC 24、48 h后细胞活力高于正常组，这就说明用药剂量范围内LU发酵液对正常内皮细胞无毒性作用，反而促进细胞的增殖，见表1。

2.2 LU发酵液对损伤细胞存活率及LDH的影响

如表2所示，模型组细胞存活率显著低于正常组，LDH活性显著高于正常组，说明H2O2作用以后损伤或死亡的内皮细胞数增多。用LU发酵液预处理以后，中、高剂量组细胞活力显著高于模型组，且高剂量组的LDH活性显著低于模型组，这就提示LU发酵液具有保护HUVEC的作用。

表1 LU发酵液对正常HUVEC存活率的影响Table 1 Effect of LU fermentation broth on survival rates of HUVECs

表2 LU发酵液对损伤细胞存活率及LDH的影响Table 2 Effect of LU fermentation broth on surviaval rates and LDH of cells with injury

2.3 LU发酵液对细胞凋亡的影响

图1中A～E均为由四个象限组成的细胞直方图，每个图中左下象限代表正常细胞群（An-PI-），右下象限代表早期凋亡细胞群（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+），左上象限代表为非特异死亡细胞（An-PI+）。与正常组相比，模型组凋亡率（47.24%）显著增多，说明H2O2诱导的HUVEC凋亡模型制备成功。各剂量用药组凋亡数明显减少（p＜0.05），但无量效关系。

2.4 Bax、Bcl-2、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白质的表达结果

如图2所示，与正常组比较，模型组Bax、Caspase-9和Caspase-3基因表达显著增加，而Bcl-2基因表达变化不明显。与模型组比较，各剂量用药组Bax、Caspase-9和Caspase-3基因表达减少，而Bcl-2基因表达增多。

3 结语

图1 LU发酵液对HUVEC细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of LU fermentation broth on apoptosis of HUVEC

MTT法常用于生物活性因子的活性检测。本实验中所用的剂量范围内榆干离褶伞发酵液对HUVEC无细胞毒性，促进HUVEC的增殖。过氧化氢诱导HUVEC损伤后细胞存活率显著下降，而用榆干离褶伞发酵液预处理时，其存活率明显增高，这就提示榆干离褶伞发酵液对HUVEC的氧化损伤有保护作用。我们曾报道过榆干离褶伞发酵液的抗氧化作用[2]，由此可认为榆干离褶伞发酵液对HUVEC的保护作用与其抗氧化作用密切相关。当过氧化氢作用于HUVEC后，导致细胞的氧化损伤，由此细胞的完整性遭到破坏，引起细胞膜的通透性增加，导致细胞上清液LDH活性增加。以榆干离褶伞发酵液处理细胞后，因它对细胞有保护作用，所以用药组细胞上清液的LDH活性明显降低。

图2 LU发酵液对Bax、Bcl-2、Caspase-9和 Caspase-3蛋白质的表达的影响Fig.2 Effect of LU fermentation broth on the protein expression of bcl-2,bax,caspase-3 and caspase-9

为了进一步探讨榆干离褶伞发酵液对HUVEC的保护作用机制，用过氧化氢诱导细胞凋亡模型，观察了榆干离褶伞对凋亡的影响。实验结果显示，模型组凋亡率47.24%，而用药组凋亡率明显下降，分别为18.1%、19.62%、13.47%，这就说明榆干离褶伞具有抑制凋亡的作用。在细胞凋亡调控的众多基因中，Bcl-2和Bax是关键基因，其中BcI-2是凋亡抑制的基因，而Bax是凋亡促进基因。而当Bax在细胞内超表达时，Bax/Bax同源二聚体的数量明显增多，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡；而当Bcl-2高表达时，则Bax/Bax二聚体大量解离，生成更为稳定的Bcl-2/Bax异源二聚体，对抗其诱导凋亡的作用[5]。本实验中，经过氧化氢诱导细胞凋亡后，模型组的Bax表达比正常组明显增多；在用药组中其表达量随着剂量的增加逐渐减少，而Bcl-2的表达逐渐增多，这就提示榆干离褶伞发酵液可拮抗由过氧化氢引起的细胞凋亡。研究证实，H2O2主要通过激活经典的线粒体途径诱导细胞凋亡[6]。在线粒体通路凋亡途径中，当细胞受到过氧化氢等氧化应激刺激时，线粒体膜通透性增加，释放出细胞色素 C，并与细胞凋亡激活因子 1（Apoptotic protease activating factor l，Apaf-）结合， 并活化Caspase-9的前体，进而激活Caspase-3，进而诱导细胞凋亡[7]。有文献报道，Bax是在线粒体外膜通过形成离子通道方式促进细胞色素C等蛋白质分子释放[8]。本实验结果显示，与正常组比较，模型组Caspase-9和Caspase-3明显增加，表明过氧化氢通过影响Bax基因的表达，促进线粒体释放大量的包括细胞色素C在内的蛋白质，诱导Caspase的激活。用榆干离褶伞发酵液预处理后，Bax/Bcl-2比值下降，Caspase-9和Caspase-3基因表达减少，这就提示榆干离褶伞发酵液可能通过抑制或阻断线粒体凋亡通路，对血管内皮细胞起保护作用，而这种保护作用有可能作为它的溶栓作用机制之一。

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