不同蛋白酶的猪、兔骨酶解液对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的比较

曾 珍， 李 诚， 付 刚， 苏 赵， 杨 勇， 何 利， 胡 滨

（四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625014）

我国是各类动物骨生产的大国，据统计每年约有2 183万t的各类动物骨骼产生[1]，但绝大多数骨头都没有得到充分利用。骨头含有大量的骨胶原蛋白，这些蛋白质所含氨基酸种类较为丰富[2]，是一种良好的蛋白源。近年来针对动物骨的利用开发引起了科研人员的关注，特别是通过水解动物骨获得功能肽成为了研究的热点。赵玲等人从鳕鱼骨里提取出具有抗氧化作用的胶原蛋白肽[3]。Saiga等人也从鸡腿骨里提取出了具有抗高血压活性的多肽，其氨基酸序列为Gly-Ala-Hyp-Gly-Leu-Hyp-Gly-Pro，且其活性较高（IC50=29 mmoL/L）[4]。YANG Hua等人用木瓜蛋白酶从羊骨里提取出免疫活性肽[5]。免疫活性肽通常被认为是一种能够增强机体免疫力[6]、增强巨噬细胞吞噬功能[7]、提高机体抵御外界病原体感染能力[8]，因其相对分子质量低、活性强、用量少、稳定性强、生物活性高的独特优势受到了人们的重视。作者采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶分别水解猪骨、兔骨，研究各水解产物的对小鼠脾淋巴细胞增殖活性，为利用猪、兔骨制备免疫活性肽提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜猪骨（猪后腿股骨头）、兔骨（除头骨以外的全身骨骼）：市售；昆明种小鼠：5周龄，体重18 g，雌性，由四川农业大学兽医院提供；胰蛋白酶（7.8×104U/g）、木瓜蛋白酶（13×104U/g）：广西南宁庞博生物有限公司；Alcalase 碱性蛋白酶（11.5×104U/g）：丹麦NOVO公司；其它试剂：均为分析纯。

1.2 主要仪器

BR4i型多功能冷冻离心机：法国THERMO JOUAN公司；iMark酶联免疫检测仪：美国伯乐公司；311型CO2培养箱：美国Thermo Scientific公司；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；PHS-3C酸度计：方舟科技公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酶解工艺流程 猪、兔骨（剔净残肉、皮、腱、软骨及其它非骨骼成分）→宰碎至5～6 cm→脱脂（1∶1 甲醛/氯仿 37 ℃，浸泡 24 h）[9]→蒸馏水清洗（除去残渣）→高压蒸煮2 h（0.1 MPa，121℃）→常温干燥→粉碎→过筛（80目）→加入100 mL蒸馏水→混匀→预处理（90℃热处理10 min）→冷却至常温→调节pH到指定值→加入一定量的酶在指定温度下酶解指定的时间→灭酶 （100℃、10 min）→离心过滤（8 000 g 20 min），取上清液测定脾淋巴细胞增殖率。

1.3.2 猪、兔骨酶解工艺参数的单因素实验

1）底物浓度对酶解效果的影响：用胰蛋白酶（温度50℃、pH 8、酶底比5 000 U/g、水解时间4 h）、木瓜蛋白酶（pH 7、酶底比 5 000 U/g、水解时间4 h，水解温度60℃）和Alcalase碱性蛋白酶（pH 9、酶底比6 000 U/g、水解时间2 h、温度55℃）酶解不同底物蛋白质量分数2%、4%、6%、8%、10%的猪、兔骨，测定其对小鼠脾淋巴细胞增殖率。

2）温度对酶解效果的影响：以小鼠脾淋巴细胞增殖率为指标，在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、pH 8、酶底比5 000 U/g、水解时间4 h的条件下研究不同水解温度 30、40、50、60、70 ℃对胰蛋白酶酶解效果的影响；在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、pH 7、酶底比5 000 U/g、水解时间4 h条件下，研究不同水解温度 50、55、 60、65、70 ℃对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、pH 9、酶底比6 000 U/g、水解时间 2 h下研究40、45、50、55、60 ℃对 Alcalase 碱性蛋白酶酶解效果的影响。

3）pH值对酶解效果的影响：以小鼠脾淋巴细胞增殖率为指标，在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、水解温度50℃、酶底比5 000 U/g、水解时间4 h条件下，研究pH 7、7.5、8、8.5对胰蛋白酶酶解效果的影响；在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、水解温度60℃、酶底比5 000 U/g、水解时间5 h条件下，研究不同 pH 5、5.5、6、6.5、7 对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、水解温度50℃、酶底比6 000 U/g、水解时间2 h条件下研究 pH 8、8.5、9、9.5、10 对 Alcalase 碱性蛋白酶酶解效果影响。

4）酶与底物蛋白浓度比对酶解效果的影响：以小鼠脾淋巴细胞增殖率为指标，在猪、兔骨底物蛋白质量浓度6%、水解温度50℃、pH 8、水解时间4 h条件下，研究不同酶底比 4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g对胰蛋白酶酶解效果的影响；在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、水解温度60℃、pH 7、水解时间4 h条件下，研究不同酶底比4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g 对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%、水解温度50℃、pH 9、水解时间2 h的条件下研究不同的酶与底物比 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g对Alcalase碱性蛋白酶酶解效果的影响。

5）时间对酶解效果的影响：以小鼠脾淋巴细胞增殖率为指标，在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%，pH 8，温度50℃，酶底比5 000 U/g条件下，研究不同水解时间 3、4、5、6、7 h 对胰蛋白酶酶解效果的影响。在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%，pH 7，温度60℃，酶底比5 000 U/g条件下，研究不同水解时间2、3、4、5、6 h对木瓜蛋白酶酶解效果的影响；在猪、兔骨底物蛋白质量分数6%，pH 9，温度50℃，酶底比 6 000 U/g 条件下研究不同酶解时间 2、3、4、5、6 h对Alcalase碱性蛋白酶酶解效果的影响。

1.3.3 优化猪、兔骨酶解工艺参数的正交实验 根据单因素实验结果确定酶解的底物蛋白质量分数为6%，选用Alcalase碱性蛋白酶水解猪骨，选用木瓜蛋白酶水解兔骨，选择水解温度（℃）、pH值、水解时间（h）、酶/底物（U/g）作为实验因子，采用 L9（34）正交实验设计。以脾淋巴细胞增殖率为主要指标，确定蛋白酶酶解猪、兔骨蛋白的最佳工艺参数。

1.3.4 检测方法

1）酶活性测定：福林酚法SB/T 10317-1999。

2）蛋白质的测定：凯氏定氮法（GB5009.5—2010）。

3）水解度的测定：采用双指示剂甲醛滴定法[10]。

4）无菌小鼠脾淋巴细胞制备：小鼠禁食12 h，摘眼球放血后脱颈处死，浸泡在75%的乙醇中3～5 min，于超净工作台上无菌打开腹腔，取出小鼠脾脏置于含有无菌Hanks液的平皿中，去除外周结缔组织，并用无菌Hanks液清洗脾脏，去除血液。用无菌注射器芯挤压研磨，制成细胞悬液。用Hanks液洗3次，然后于1 500 r／min离心8 min，弃上清液。然后将细胞悬浮于2 mL的RPMI 1640完全培养液中。调整细胞浓度为 2.0×106个 ／mL[11-12]。

5）MTT法测定脾淋巴细胞增殖：设实验组和对照组。在96孔板中每孔加入已制备好的小鼠脾细胞悬液100 μL。对照组加入RPMI 1640完全培养液 100 μL，实验组加入 100 μL 酶解液，置于 37℃下5%CO2培养箱中培养68 h，再加入MTT 50 μL，4 h培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。室温下放置15 min后，用酶联免疫检测仪，于570 nm波长测定光密度值[13]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 底物蛋白质量浓度对酶解效果的影响 由图1可知，随着底物蛋白质量分数的增加，酶解液的脾细胞增殖率也在升高，在6%时脾细胞增殖率达到最高，而后脾细胞增殖率开始下降。因此6%为最适的底物浓度。

图1 底物蛋白浓度对脾淋巴细胞增殖率的影响Fig.1 Effect of Substrate concentration on proliferative activity of spleen cells

2.1.2 温度对酶解效果的影响 由图2可知，随着温度的升高，酶解液的脾细胞增殖活性呈先升高后下降的趋势。胰蛋白酶最适温度范围为50～60℃，木瓜蛋白酶的最适温度范围为55～65℃，Alcalase碱性蛋白酶最适温度为45～55℃。

2.1.3 pH值对酶解效果的影响 由图3可知，随着pH值的升高，酶解液的脾细胞增殖活性呈先升高后下降的趋势。胰蛋白酶最适pH值范围为7.5～8，木瓜蛋白酶的最适pH至范围为5.5～65，Alcalase碱性蛋白酶最适pH值范围为8.5～9.5。

图2 温度对脾淋巴细胞增殖率的影响Fig.2 Effect of temperature on proliferative activity of spleen cells

图3 pH值对脾淋巴细胞增殖率的影响Fig.3 Effect of pH on proliferative activity of spleen cells

2.1.4 酶与底物蛋白浓度比对酶解效果的影响由图4可知，随着酶底比的升高酶解液的脾细胞增殖活性呈先升高后下降的趋势。胰蛋白酶最适酶底比范围为6 000～7 000 U/g，木瓜蛋白酶的最适酶底比范围为5 000～7 000 U/g，Alcalase碱性蛋白酶最适酶底比范围为4 000～8 000 U/g。

2.1.5 时间对酶解效果的影响 由图5可知，随着水解时间的增加酶解液的脾细胞增殖活性呈先升高后下降的趋势。胰蛋白酶最适水解时间比范围为4～5 h，木瓜蛋白酶的最适水解时间范围为3～5 h，Alcalase碱性蛋白酶最适水解时间范围为3～5 h。

图4 酶底比对脾淋巴细胞增殖率的影响Fig.4 Effect of E/S on proliferative activity of spleen cells

图5 水解时间比对脾淋巴细胞增殖率的影响Fig.5 Effect of time on proliferative activity of spleen cells

2.2 Alcalase碱性蛋白酶酶解猪骨实验结果

由单因素实验结果可知，三种蛋白酶酶解兔骨产物对小鼠脾细胞增殖作用的强弱为：木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞Alcalase碱性蛋白酶，因此选用木瓜蛋白酶作为酶解兔骨正交实验的使用酶。

由表1和表2分析知，在Alcalase碱性蛋白酶酶解猪骨正交实验中，酶与底物比、温度、pH、时间四个因素对脾细胞增殖率的影响顺序为：酶与底物比＞pH＞时间＞温度，其中pH、酶与底物比的影响显著（P＜0.05），最优组合为：时间 4 h、pH 9.5、酶与底物比6 000 U/g、温度45℃。通过对两个指标的极差和方差分析，选择脾细胞增殖能力的最优组合为最佳组合，即利用Alcalase碱性蛋白酶酶解猪骨的最佳反应条件为：时间4 h、pH 9.5、酶与底物比6 000 U/g、温度45℃、底物质量分数6%。验证实验测得在最佳条件下酶解液的水解度为16.82%，脾细胞增殖率为83.41%。

表1 Alcalase碱性蛋白酶酶解正交实验结果及分析Table 1 Results and analysis of alcalase orthogonal test

表2 Alcalase蛋白酶方差分析表Table 2 Analysis of variance from alcalase orthogonal test

2.3 木瓜蛋白酶酶解兔骨实验结果

由单因素实验结果可知，而三种蛋白酶酶解猪骨产物对小鼠脾细胞增殖作用的强弱为：Alcalase碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶。因此Alcalase碱性蛋白酶作为酶解猪骨正交实验的使用酶。

由表3和表4分析知，在木瓜蛋白酶酶解兔骨正交实验中，酶与底物比、温度、pH、时间四个因素的对对脾细胞增殖率的影响顺序为：时间＞温度＞酶与底物比＞pH，其中时间和温度的影响显著 （P＜0.05），最优组合为：时间 4 h、pH 5.5、酶与底物比7 000 U/g、温度65℃。通过对两个指标的极差和方差分析，选择脾细胞增殖能力的最优组合为最佳组合，即利用木瓜蛋白酶酶解兔骨的最佳反应条件为时间4 h、pH 5.5、酶与底物比 7 000 U/g、温度 65 ℃、底物质量分数6%。验证实验测得在最佳条件下酶解液的水解度为16.25%，脾细胞增殖率为80.70%。

表3 木瓜蛋白酶酶解正交实验结果及分析Table 3 Results and analysis of Papain orthogonal test

表4 木瓜蛋白酶方差分析表Table 4 Analysis of variance from papain orthogonal test

2.4 水解度对小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响

图6为木瓜酶解兔骨产物和Alcalase碱性蛋白酶酶解猪骨产物的水解度对脾细胞增殖活性的影响。在Alcalase碱性蛋白酶酶解条件下，随着DH的增加，脾细胞增殖率呈先增加后减小的趋势。水解度在15%～18%时，酶解液对小鼠脾淋巴细胞增殖率最高。而在木瓜蛋白酶酶酶解条件下，随着DH的增加，脾细胞增殖率也呈增加的趋势，但水解度均没有超过17%。

图6 水解度对脾细胞增殖活性的影响Fig.6 Effects of degree of hydrolysis on proliferative activity of spleen cells

3 结语

蛋白质中包含有许多生物活性序列，其中包括多种免疫活性肽，这些生物活性肽，均以无活性的形式存在于蛋白前体物中，只有用适当的蛋白酶水解并从蛋白中释放出来后，才能成为具有生理活性的肽段[14]。用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶分别酶解猪、兔骨，得到的酶解液对小鼠脾淋巴细胞均有增殖作用，这是因为水解物能诱导细胞因子的释放，这些细胞因子能够激活免疫细胞产生免疫应答[15]。蛋白酶对水解的肽键具有专一性，所以不同蛋白酶对不同底物的作用结果不同[16]。胰蛋白酶酶解底物的脾细胞增殖活性强弱为：兔骨＞猪骨；木瓜蛋白酶酶解酶解底物的脾细胞增殖活性强弱为：兔骨＞猪骨；Alcalase碱性蛋白酶酶解底物的脾细胞增殖活性强弱为：猪骨＞兔骨。经过正交实验可知，在猪骨最佳水解条件下得到的小鼠脾细胞增殖率为83.41%，略高于在兔骨最佳水解条件下得到的小鼠脾细胞增殖率80.70%。由实验结果可以看出，水解度对免疫活性影响显著。随着DH的增加，脾细胞增殖率呈先增加后减小的趋势。这可能是因为随着酶解程度的提高，酶解物中有活性的短肽被分解成氨基酸或其活性基团被破坏，从而导致产物活性下降[7]。因此水解度在15%～18%时，酶解液对小鼠脾淋巴细胞增殖率最高。Hou和Kong等研究发现，水解度以及影响水解度的各因素如加酶量、底物质量浓度、pH、温度等，对酶解鳕鱼骨架和大豆蛋白质得到的多肽的体外免疫活性有显著影响[17-18]。

研究结果表明，酶解猪骨的最佳酶为Alcalase碱性蛋白酶，其最佳条件为时间4 h、pH 9.5、酶与底物比6 000 U/g、温度45℃、底物质量分数6%，其小鼠脾细胞增殖率为83.41%；酶解兔骨的最佳酶为木瓜蛋白酶，其最佳条件为时间4 h、pH 5.5、酶与底物比7 000 U/g、温度65℃、底物质量分数6%，其小鼠脾细胞增殖率为80.70%。

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