番茄黄化曲叶病毒（TY）侵染性克隆接种鉴定方法研究

张少丽，邵景成，胡志峰

（甘肃省农业科学院蔬菜研究所，甘肃 兰州 730070）

番茄已成为我国种植面积最大的蔬菜作物之一，但由于番茄黄化曲叶病毒病（TY）的大面积爆发，严重制约了番茄产业的进一步发展。据各地植保部门的不完全统计，我国番茄TY的年发生面积超过6.7万hm2，年经济损失至少20亿元［1～2］。TY一旦发生，防治效果较差。预防该病最有效的措施是培育抗病品种，而抗病品种的选育，从抗源材料的筛选、后代分离群体的选择，直到品种的推广，都离不开抗病性鉴定。

目前对TY鉴定方法有分子标记检测、带毒烟粉虱侵染、发病环境下自然接种、含TY-DNA的侵染性克隆注射接种等。虽然分子标记简单易行，但由于其与抗病基因间存在一定的遗传距离，检测结果与实际抗病性间很难达到100%吻合，需要结合其它方法做进一步的验证。在没有自然发病的地区利用带毒烟粉虱侵染、发病环境下自然接种的方法，生态风险很大，采用TY-DNA的侵染性克隆注射接种法可弥补以上不足［3］。甘肃省兰州市尚未发现TY的发生，我们开展了TY-DNA侵染性克隆接种鉴定方法研究，初步确立了一套无发病区采用侵染性克隆接种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，以期为抗TY番茄品种的选育和防止TY的发生提供有效手段。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试番茄品种为感TY番茄品种MM、中蔬4号（由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供）和鲜食番茄杂交组合98-B1（由甘肃省农业科学院蔬菜研究所提供）。

用于苗期接种的TY-DNA侵染性克隆pBin-PLUS-1.7A+2β（农杆菌）引自浙江大学周雪平教授实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 育苗 实验材料于2014年5月12日播种于50孔的育苗穴盘中，置育苗温室中培养，4～6叶时进行苗期接种。

1.2.2 培养基配制 液体培养基配制：YEP1—牛肉膏1%，酵母提取液1%，NaCl 0.5%，pH 7.0；YEP2—胰蛋白胨1%，酵母提取液1%，NaCl 0.5%，pH 7.0。固体培养基是在上述液体培养基中分别加入0.8%的琼脂即可。

1.2.3 农杆菌的培养 将配制好的培养基在120℃下灭菌30 min，取出晾至37℃左右，加入利福平（50 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）。在液体培养基中接入农杆菌菌种，200 r/min、28℃过夜摇菌，进行活化。将活化好的农杆菌接种于固体培养基中28℃倒置暗培养，得到固体菌落。挑取单菌落，接种于液体培养基中培养，培养至菌液浓度为OD600≈0.6、OD600≈1.0。共得到 6种不同状态的含TY-DNA的农杆菌，即YEP1固体菌落、YEP1液体菌菌液浓度OD600≈0.6、YEP1液体菌菌液浓度OD600≈1.0；YEP2固体菌落、YEP2液体菌菌液浓度OD600≈0.6、YEP2液体菌菌液浓度OD600≈1.0。

1.2.4 接种 于2014年6月18日（番茄4～6叶苗龄）时进行接种。菌液接种时采用韧皮部（距根部1～2 cm处）人工注射接种［3］，每株0.5 mL左右，每品种每处理各接种10株。固体菌落接种时，用牙签戳破韧皮部（距根部1～2 cm处），刮取固体菌落，涂抹于伤口，每品种接种10株，对照（不接种）为10株。接种后20、30、45 d观察植株发病症状，统计发病率。

图1 MM、中蔬4号、98-B1接种30 d植株发病情况（以YEP2液体菌菌液浓度OD600≈0.6接种为例）

2 结果与分析

2.1 番茄TY的发病过程

对接种植株观察发现，接种后20 d内植株不表现发病症状。接种后30 d时，大部分接种植株上部叶片出现轻微黄化，各处理间发病程度无差异，但品种间发病程度不同，具体发病程度由高到低依次表现为MM、中蔬4号、98-B1（见图1）。接种后45 d时，接种植株明显生长缓慢或停滞，上部叶边缘上卷、黄化、皱缩，表现为充分感病，各处理间及品种间发病程度差异均不明显（见图2）。

图2 MM、中蔬4号、98-B1接种45 d植株发病情况（以YEP2液体菌菌液浓度OD600≈0.6接种为例）

2.2 植株发病情况

接种45 d后，所有接种植株已充分发病，而同一穴盘的对照植株完全正常，说明该病不会通过土壤、水分传播，也表明育苗温室内不存在传毒媒介烟粉虱。处理发病率统计结果（表1）表明，处理间差异不明显，固体菌落接种以YEP2固体菌落接种的发病率效果较高，液体菌菌液接种以YEP1液体菌菌液浓度OD600≈0.6和YEP2液体菌菌液浓度OD600≈0.6接种的发病率效果较好。综合考虑认为，当液体菌（无论YEP1还是YEP2）菌液浓度为OD600≈0.6时，发病效果较好。

表1 接种植株发病率调查结果

3 小结与讨论

1）利用含TY-DNA的侵染性克隆进行注射接种，无论是被用做番茄转基因研究的常用品种MM、中蔬4号，还是鲜食番茄杂交组合98-B1，都能正常发病，发病程度也无太大差异，预示该方法有一定的广适性。

2） 根据研究结果初步判定，各处理间差别不明显。相比之下，当2种液体培养基菌液浓度为OD600≈0.6时发病率较高。但采用固体菌落接种操作简单，易于掌握，适合大量材料的鉴定。

3）从环境安全方面考虑，侵染性克隆接种方法具有很大优势，不会带来生态风险。另外，该方法能够比较客观的反应材料的真实抗病性，大大降低了自然接种下不同年份环境因素的干扰及带毒烟粉虱的喜食偏好等因素的影响。

4）本实验对2种不同培养基培养的固体菌落及不同浓度的菌液进行了接种比较，初步确立了一套无发病区采用侵染性克隆接种鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性的方法，为今后的抗TY番茄品种的选育奠定了基础。

［1］ 龚一帆，杜永臣，谢丙炎，等.威胁番茄生产的新病害——番茄黄化曲叶病毒病［J］.中国蔬菜，2009（21）：1-4.

［2］ 胡志峰，邵景成.甘肃省设施番茄黄化曲叶病毒病的发生与防治［J］. 甘肃农业科技，2014（1）：54-56.

［3］ 陶小荣.中国番茄黄化曲叶病毒致病分子机理及其卫星DNA诱导的基因沉默研究［D］.杭州：浙江大学，2004.