自由基生物学在运动医学中的应用研究

熊正英

（陕西师范大学 体育学院，陕西 西安 710119）

自由基的概念最早是在18世纪末化学家在研究化学反应时提出来的，那时猜测自由基是一些不稳定的基团.Gomberg于1900年在用氯化三苯甲基制备六苯乙烷时首先分离出稳定的自由基（三苯甲基自由基），才在世界上最早肯定了自由基的客观存在［1］.随着实验数据的积累及电子自旋共振（ESR）仪的发明，自由基的概念也在不断扩展和完善.

1956年Harman在分子生物学的基础上提出自由基（Free Radial）学说，其主要论点是生物体内进行新陈代谢的过程中必然会产生一些副产物，它们与体内某些化学物质发生作用而造成机体的损害［2］.几十年来，随着分子生物学的发展以及自由基研究技术和方法的突破，自由基生物学有了很大的发展.大量的研究表明:自由基参与了如炎症、肿瘤、某些心血管疾病与细胞增殖等许多病理过程.1980年以后一些研究者对自由基的定义进行了扩展:外层电子轨道含未成对电子的基团称为自由基，也称游离基.自由基的基本特征是具有一个未成对电子，在所有分子成键过程中，电子都是倾向配对的，因此自由基中的未成对电子也具有配对的倾向.大多数自由基都很活泼，反应性极强，容易反应生成稳定分子，这是自由基的一个非常重要的性质，也是自由基生物学和医学的重要内容.

1978年Dillard首次把自由基的研究引入运动医学领域，推动了运动医学的发展［3］.在大强度运动逆境生理状态下，机体也会产生大量的自由基，导致自由基生成和消除失去平衡，过多的自由基会对生物大分子、亚细胞器、细胞、组织、腺体等造成损伤，使机体结构破坏，机能下降，出现运动疲劳或造成机体伤害.如何防止大强度运动时机体产生大量自由基影响运动能力以及对机体的伤害，在我国运动医学领域从20世纪90年代以来先后进行了大量实验研究，并逐渐形成了运动自由基生物学研究方向.

1 自由基生物学

1.1 自由基的产生

自由基是机体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，引起体内自由基生成的因素既有内源性的，也有是外源性的.导致自由基产生的原因主要有:（1）外界诸多理化因素（如电离辐射、大气污染、吸烟等）都会导致生物体内产生自由基；（2）生物体内尚有许多非酶促反应和酶促反应（如吞噬细胞系统、线粒体和微粒体电子传导系统、脂质过氧化过程的反应）也会诱发产生自由基；（3）机体在代谢过程中（如酶的催化、电子传递、细胞成分的自动氧化等）或受高能辐射和光分解等作用，也是引起产生自由基的重要因素；（4）空气中的氧化性污染物（如O3、NO2和NO等）也能在体内启动自由基反应。因此，导致机体内自由基增多的原因归纳起来主要有紫外线、宇宙射线、各种放射性物质、体内代谢紊乱、创伤、感染、吸烟、缺血和炎症反应等.

1.1.1 非酶促反应 非酶促反应中O2能从还原剂接受一个电子（1/4还原）转变为.甘油醛、还原型核黄素、FMN与FAD、肾上腺素、四氢喋呤等生物分子氧化时可产生.在离体实验中已证明Fe3＋是稳定的，而Fe2＋可在空气逐渐被O2氧化为Fe3＋，同时O2转变为O2－·，红细胞中氧合血红蛋白可转变为蛋白质－血红素-Fe3＋-，但也可再转变为氧合血红蛋白.一部分蛋白质－血红素-Fe3＋-可分解成高铁血红蛋白及.机体中每天有3%红细胞中的氧合血红蛋白转变为高铁血红蛋白，表明循此途径有相当量的产生.

1.1.2 酶促反应 在氧代谢反应中常有酶促氧化与还原，也会产生.在胞浆黄嘌呤氧化酶的催化下，黄嘌呤或次嘌呤可通过单电子给予O2的方式氧化为尿酸，同时产生.而存在于胞浆中醛氧化酶可催化醛与氧反应生成酸与.在线粒体呼吸链中，CoQH2和氧化型CoQ10氧化还原的中间产物就是CoQ10H·，其可自氧化生成；在微粒体中产生的反应可能是通过黄素蛋白漏传电子到O2，或是通过细胞色素P450催化底物羟化的过程中，其辅基与底物结合而成的化合物，经单电子还原为Fe2＋-血红素-AH 后，在O2存在下迅速转变为Fe2＋－血红素－AH－O2.后者分子中的 Fe2＋－O2与 Fe3＋－可相互转变，其中Fe3＋－O2－·可能释放，Fe3＋－在接受单电子生成 Fe2＋-时，也有释放的可能［5］.

1.2 生物体内自由基种类

常见的自由基如表1所示.1968年 Mc Cord等［6］发现组织中广泛存在着能清除超氧阴离子自由基（）的SOD及其生物学作用后，生物体内存在内源性自由基才得到大量的实验证据.是生物体内其他活性氧的主要来源.生物体内活性氧在吸收电子后先转化为，继而产生各种氧自由基如过氧自由基（ROO·）、羟自由基（·OH）、烷氧自由基（RO·）等形式.与脂质发生反应，生成脂质过氧化物（LPO）:LO·、LOO·以及LOOH；另外与NO结合而成为ONOO－及其质子化产物ONOOH也可具有活性氧的特征，但它们属于活性氮.人们通常把这些自由基及氧的代谢产物和一些反应的含氧产物统称为活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），而ROS中一些不配对的电子位于含氧的基团中则称为氧自由基（Oxygen Free Rabi-cal，OFR），这些自由基性质十分活泼，极易攻击机体组织，造成氧化性损伤.自由基在生物体细胞的线粒体、内质网、细胞核、质膜和泡液中都可以不断地通过非酶促反应和酶促反应产生.

表1 具有氧化应激意义的活性氧Tab.1 The active oxygen with oxidative stress

1.3 影响机体产生自由基的因素

导致机体内自由基增多的原因很多，包括机体非正常代谢产物、有毒化学品接触或毒品、吸烟、酗酒、长时间的日晒、长期生活在富氧/缺氧环境、环境污染、过量运动、疾病、不健康的饮食习惯（营养过剩以及脂肪摄入过量）、辐射污染和心理因素等［7］.

1.4 自由基对生物分子的损伤及其危害

由于自由基高度的活泼性与极强的氧化反应能力，能通过氧化作用来攻击其所遇到的任何分子，使机体内大分子物质产生过氧化变性，交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体组织损害和器官退行性变化.正常人每天每个细胞可受到103～104次自由基的攻击［18］，生物体内自由基不能完全被消除，在一定条件下会造成生物分子的损伤，这些损伤主要指对维持生命活动具有重要作用的蛋白质和DNA的损伤.这种损伤是ROS直接引发蛋白质和DNA的氧化作用，也可能是间接通过脂质过氧化和糖化氧化作用产生的新的羟基对蛋白质和DNA的修饰.

1.4.1 自由基对生物分子的损伤［7］

1.4.1.1多不饱和脂肪酸过氧化——膜损伤 脂质中的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受自由基的破坏发生氧化反应.磷脂是构成生物膜的重要部分，因富含多不饱和的脂肪酸故极易受自由基所破坏.自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，使之氧化，产生过氧化脂质，会改变细胞膜的通透性，使细胞的功能和代谢发生改变，会引起细胞功能的极大紊乱.过氧化脂质还可与蛋白质结合形成脂褐素，沉积于皮肤，即黄褐斑、老年斑，是衰老的象征.

图1 脂质过氧化作用Fig.1 Effect of lipid peroxidation

一般将不饱和脂肪酸的氧化变质称为脂质过氧化（Lipid Peroxidation，LPO），脂质过氧化过程（如图1所示）是一个产生自由基和自由基参与的链式反应.脂质过氧化过程主要发生在生物膜上，即ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物如丙二醛 （Malonaldehyde，MDA）和4－羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal，HNE），从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的改变.脂质过氧化作用一旦被引发，就可以持续地进行，不断生成L·、LOO·和LOOH及一些稳定的非自由基产物.

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红细胞膜易产生脂质过氧化作用，这是由于膜含有PUFA并直接暴露在O2下，脂质过氧化作用导致红细胞膜的硬度增加，失去变形能力，在微血管的积压下，最终导致溶血.线粒体和微粒体膜易于受过氧化作用，一方面是由于它们含有较大量的PUFA，另一方面又含有过氧化作用依赖的血红素蛋白质.脂质过氧化作用不仅使膜酶受到损伤或激活，而且使膜失去作为分隔间（区域化）的功能，如同蛋白质和酶的聚合交联一样，导致按功能需要排列的酶的紊乱.膜的脂质过氧化，膜中PUFA受到破坏，使膜的流动性下降和膜的通透性增加，正常不能透过膜的物质（如Ca2＋）的通透量增加.膜中蛋白质的聚集和交联不但使酶活性发生改变，而且可使膜上的受体失活.这一系列的变化必然导致细胞代谢、功能和结构的改变.

1.4.1.2 蛋白质的氧化损伤 蛋白质的氧化作用可以是主链的氧化作用或是侧链氨基酸残基的氧化和过氧化.蛋白质主链氧化，·OH攻击多肽主链，抽提氨基酸残基上的α氢原子形成蛋白质自由基（Pr·），并且Pr·很快与O2反应形成蛋白质过氧基，其能生成蛋白质氢过氧化物，继而形成PrO·，进而转变成羟基蛋白衍生物（PrOH）.在这通路中形成的Pr·、Pr··、PrOO··都能与同一蛋白质或不同蛋白质的氨基酸残基发生抽氢反应生成新的Pr·（如图2所示）.Pr·在无氧条件下，不能与O2反应，两个Pr·相互加成反应形成一个蛋白质－蛋白质交联物.PrOOH能被GSH-Px催化还原生成相应的羟基衍生物PrOH，其在过渡金属离子的催化下能生成PrO·和PrOO·.均裂生成蛋白质断裂，表现在Pr能通过一定的通路裂解，生成不同的肽片断.受到氧化的蛋白质通常失去功能活性，氧化蛋白的伸展增加了它对蛋白酶的敏感性，因此细胞通过蛋白水解作用可以除去氧化蛋白.但有些氧化蛋白交联后，难以被细胞处理，特别是在衰老过程和某些病理情况下氧应激增强，氧化蛋白的生成速率增加，细胞羰基蛋白含量增加，蛋白功能受损，包括蛋白酶受损，酶活性降低.

图2 蛋白质氧化损伤机制Fig.2 Mechanism of oxidative damage of protein

1.4.1.3 自由基对DNA的损伤 自由基攻击核酸会引起一系列的化学变化［8］，诸如氨基或羟基的脱除、碱基与核糖连接键的断裂、核糖的氧化和磷酸酯键的断裂等.甚至DNA的同一条链内和相邻两条链间核苷酸可能发生链内交联与链间交联.在生物体内能使DNA发生损伤的ROS主要是·OH，其攻击DNA有两种形式，首先是·OH对脱氧核糖攻击，抽取H，使脱氧核酸－磷酸骨架拆开而造成链断裂，然后将·OH夹到DNA碱基的π键上，如嘌呤的C4与C8和嘧啶的C5与C6.其氧化产物以8－羟基脱氧鸟苷（8-OH-deoxy G）最引起重视，尿液中8-OH-deoxy G排出量反映了生物体DNA受到氧化损伤后经切除修复排出的产物量.因此，8-OH-deoxy G是监测生物体内ROS对DNA损伤的重要指标.

1.4.1.4 自由基与糖基氧化反应 糖基氧化作用是对生物大分子的非酶性修饰.自由基通过氧化性降解使多糖断裂，影响脑脊液中的多糖，从而影响大脑的正常功能.自由基使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，导致DNA主链断裂或碱基破坏，还可使细胞膜寡糖链中糖分子羟基氧化生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞免疫功能的发挥［20］.

1.4.2 自由基对机体的危害 机体氧化应激，会诱发产生过多的活性氧自由基，引起生物分子的不可逆破坏，导致对机体的危害.自由基对生物分子、亚细胞器、细胞、腺体和组织的损伤是其致病的主要原因.自由基损伤细胞膜，使膜的液态性、流动性改变，膜上的酶、受体及离子通道受损，内质网与线粒体结构改变，破坏三羧酸循环和呼吸链的电子传递，最终导致机体机能下降.自由基攻击正在复制中的DNA，造成基因突变，诱发癌症；自由基使机体产生过敏反应，或出现如红斑狼疮等自体免疫疾病.自由基作用使体内毛细血管脆性增加，容易破裂，导致静脉曲张、水肿等疾病的发生；自由基侵蚀机体组织，可激发机体释放各种炎症因子，导致各种非菌类炎症；自由基侵蚀脑细胞，使人得早老性痴呆；自由基氧化血液中的脂蛋白造成胆固醇向血管壁的沉积，引起心脏病和中风；自由基引起关节膜及关节滑液的降解，从而导致关节炎；自由基侵蚀眼睛晶状体组织引起白内障；自由基侵蚀胰脏细胞引起糖尿病［9］等.

2 运动自由基生物学研究

运动中或运动后机体的耗氧增加，或者是特定通路的激活，是ROS自由基产生的主要来源.1978年Dillard等［10］首次报道以50%最大摄氧量负荷踏车运动1h后，呼出气中LPO戊烷含量明显增加.1982年Davies等［11］直接证实了力竭运动后肝脏和肌肉中自由基明显增多，从而找到运动诱发自由基生成增多最直接的证据.随后大量的机体和动物实验已经证实，急性剧烈运动时，机体清除自由基的能力不足以平衡运动应激情况下产生的自由基，造成抗氧化和氧化失去平衡，引起机体和动物体内OFR产生增多，脂质过氧化增加，运动与自由基形成是一对无法避免的矛盾.同时人们也意识到，运动训练可以使机体对自由基损伤产生一定的适应能力.许多学者从不同角度揭示了力竭运动与自由基代谢［12－15］、耐力 训 练 与 自 由 基 代 谢［16－17］、急 性 运 动 与自由基代谢、无氧运动与自由基代谢的关系，并在应用自由基消除剂来抵抗过度运动所致的损伤取得一定成效［18］.

在20世纪80年代到90年代初，国内外学者做了大量工作.研究表明，在进行大强度的运动时，氧化代谢加强，机体耗氧量增加，体内氧自由基的产生随之增加.目前认为运动引起自由基增加的机制是:（1）在运动中，关节与肌肉部位明显的缺血－再灌注可以增加氧化应激，局部组织缺氧及代谢产物堆积，影响线粒体氧化功能，同时氧气大量消耗，通过线粒体呼吸链中的辅酶Q（CoQ）的氧化还原循环，使生成增多；（2）剧烈运动时耗氧量剧增，氧代谢的结果必然产生自由基；（3）随着能量消耗增加，酸性代谢产物堆积；（4）体内一些物质如儿茶酚胺类物质、血红蛋白等自身氧化增加产生大量自由基；（5）运动应激时，经黄嘌呤氧化酶产生的途径被激活；（6）机体抗氧化防御系统不能有效地清除自由基；（7）线粒体电子漏与不完全还原［19－23］.

3 自由基对运动能力的影响

自由基对运动能力影响的原因概括起来有以下几个方面［24］:（1）线粒体膜的结构受到自由基的攻击，氧化损伤，功能下降，氧化磷酸化反应速度下降，ATP合成减少，能量水平降低；（2）红细胞膜结构改变，出现溶血性贫血，氧气运输受阻，氧气供应不足，氧化反应速度降低，释放能量减少；（3）细胞膜破坏，细胞内离子浓度紊乱，膜电位改变，动作电位异常，肌肉的工作能力下降；（4）过多的自由基引起生物大分子一级结构改变，如蛋白质交联和断裂，使酶及激素催化、调节能力改变，机体的免疫力降低，机体的运动能力下降；（5）胰腺、性腺等腺体结构变化，激素分泌异常，调节功能减弱，肌糖原、蛋白质合成减少，影响运动能力［24－26］.

4 自由基清除系统的作用与运动能力

机体内的自由基不断的产生，同时也被不断地清除.体内存在抗氧化酶类及小分子抗氧化剂两类对自由基的清除系统.生物体内的抗氧化剂保护机体、对抗ROS的毒性作用的机制主要有以下几方面:预防ROS的形成；接受ROS的攻击，反应性的代谢产物使ROS转变成为低反应性的分子，或增强对ROS攻击敏感的生物学靶结构及物质的抵抗能力；避免反应性较低的ROS（如O－·2）转变成为更强烈反应性的ROS（如·OH）；有利于修复ROS引起的损伤，激发抗氧化剂蛋白质类密码基因表达；为其他抗氧化剂能发挥有效机能提供有利环境，即作为辅助因子或维持其他抗氧化剂处于还原状态.

4.1 酶促自由基清除系统

体内常见的可消除自由基、减轻其危害的抗氧化酶类主要包括SOD、GSH-Px、CAT，它们通过各自的作用途径直接清除ROS.这些酶类共同维持着体内自由基产生和消除的动态平衡.

4.2 非酶促自由基清除系统

4.2.1 维生素类自由基清除系统 维生素类自由基清 除 系 统 主 要 有 VE［27］、VC［28］、β－胡 萝 卜 素［29］等，具有抗氧化功能的维生素可直接清除与·OH.

4.2.2 有机小分子类自由基清除系统 具有巯基（—SH）或醇/酚羟基类化合物，如 GSH、α－硫辛酸［30］、半胱氨酸［31］、二硫苏糖醇［32］、辅酶 Q10［33］、茶多酚［34］等.

4.2.3 金属蛋白类自由基清除系统 该系统主要有金属硫蛋白、铜蓝蛋白等［35］.

4.2.4 植物提取物类自由基清除系统 筛选沙棘［36］、芦荟［37］、槐米［38］、迷迭香［39－40］、姜黄 素［41－42］、蒺 藜［43］、沙 苑 子［44－45］、云 芝［46－47］、竹 叶［48］、葛根［49-51］、垂 盆 草［52］、茜 草［53－54］、黄 精［55－56］、女 贞子［57］、锁阳［58］、阴地厥［59］等植物，提取其中含有的酚羟基（或酮基）等官能团类化合物清除自由基［60］.

4.2.5 水生动物及菌藻类提取物类自由基清除系统 水生动物提取物较早用于清除自由基研究的是几丁质·几丁聚糖.该物质存在于甲壳类动物及昆虫外壳中.这种物质是带正电的可食性动物纤维，是含有氨基的碱性高分子聚合物，其基本构成单位是乙酰葡萄糖胺、葡萄糖胺.研究发现补充几丁质·几丁聚糖运动小鼠各组织中SOD活性升高，MDA含量降低，表明补充几丁质·几丁聚糖能提高机体不同组织抗氧化的能力.另外几丁质·几丁聚糖还具有改善酸性体质、螯合重金属离子、促进胆固醇、可增强胰岛素受体活性、调节机体免疫水平的作用［61－62］.雨生红球藻粉含有丰富的营养物质，其中富含的天然虾青素具有超强的抗氧化和捕获自由基的能力.虾青素为脂溶性抗氧化剂，可以透过生物膜进入细胞内或黏附于细胞膜上，以终止自由基的链式反应.研究显示，雨生红球藻粉在生物抗氧化、再生其他抗氧化剂、螯合金属离子、能量代谢、激素水平、基因表达等方面都有明显的作用［63］.

已有研究结果表明，上述自由基清除系统多含有酚羟基（酮基）、巯基、共轭乙烯基、不饱和羟基等化合物，具有消除自由基，保护细胞膜不饱和脂肪酸以及细胞内的脂质、蛋白质、核酸等免受自由基的损伤的生物学功能，这就保证了机体结构和功能的完整性，维持机体正常生理功能，从而发挥延缓运动性疲劳，提高运动能力和健康水平的作用.

综上所述，可得出抗氧化系统与运动能力的关系图（见图3）.

图3 抗氧化系统与运动能力的关系Fig.3 Relationship between antioxidant system and exercise capacity

5 运动自由基研究进展

运动自由基研究内容早期主要集中在:（1）抗氧化剂降低实验动物骨骼肌、心肌、脑、肾等不同组织脂质过氧化水平，减少脂质过氧化产物MDA生成；（2）抗氧化剂可显著降低运动致疲劳的实验动物血液中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、肌酸肌酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）的活性，反映出上述物质（或药物）对动物骨骼肌、肝脏、心肌等组织细胞膜的保护作用.（3）抗氧化剂可使SOD、GSHPx和CAT活性维持在较高的水平，有利于自由基的清除，减轻自由基对机体的伤害，维持运动能力［64－65］.

进入21世纪后生物学中的技术与方法用于运动自由基研究，丰富了该方向的研究内容.通过电子显微镜技术观察运动小鼠肝脏、心肌及脑组织的超微结构变化，探讨服用抗氧化剂对小鼠能力影响的生物学机制［66－67］.采用同工酶分析技术观察补充抗氧剂对同工酶的电泳行为和酶谱分布的影响，主要包括同工酶酶带数目、光密度值和酶带迁移率（Rf）［67］.应用流式细胞仪技术观察发现补充抗氧化剂，可减缓运动中细胞凋亡的发生，延缓疲劳的产生［68］.采用基因芯片技术分析了补充抗氧化剂对实验动物相关基因表达的影响［69］.应用PCR技术研究补充抗氧化剂后长时间、大强度跑台运动后大鼠脑组织 TPH mRNA、MAO-A mRNA、GAD67mRNA、GABA-T、SSADH mRNA 表 达 水 平 的 变化［70－71］.用放射免疫法测定了补充抗氧化剂后运动训练大鼠血睾酮、胰岛素、胰高血糖素、生长激素、皮质醇等激素的水平变化［72－73］.应用高效液相色谱技术测定了长时间耐力跑台运动大鼠血清支链氨基酸（BCAA）、芳香族氨基酸（AAA）（尤其是游离色氨酸，f-Trp）、5-HTP、5-HT、Glu、γ－氨基丁酸等神经递质含量变化［74－75］.采用间接荧光染色法测定T细胞亚群；采用ConA诱导的T细胞微量测定法测定IL－2［76］.

另外，还将自由基生物学理论与方法用于心理学研究，也取得了进展，较好解释了不良心理状态下如抑郁［77］、焦虑［78］、对机体伤害及其自由剂清除剂的生物学机制，开辟了实验心理学的一个新领域［79］.

6 展望

目前，关于补充抗氧化剂能否提高机体运动能力的研究已成为运动医学领域新的研究热点，这方面的研究对象目前还多集中在动物方面.在运动员和大众人群方面，多应用动物实验所取得的研究成果，如维生素类、番茄红素、蒺藜皂甙、红景天、枸杞子等.在针对正常人体（包括运动员）抗氧化剂补充的临床实验研究中发现，补充氧化剂补后血液和/或组织抗氧化剂水平提高，血清酶活性和/或组织氧化修饰程度降低，维持和提高人体机能水平.

运动自由基生物学中有价值的研究尚显不足，有些观点尚不一致，有待进一步研究.在运动自由基生物学领域应进一步开展:（1）新的、有效的抗氧化剂筛选与开发；（2）作用机制的深度研究；（3）实际应用研究，使自由基生物学研究在大众人群健康和提高运动员竞技水平方面发挥应有的作用.

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