应用PCR技术检测哮喘5-LO E254K突变基因效果探析

吴晓东

（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）

1 引言

PCR（聚合酶链式反应）技术是指在体外快速扩增DNA目的序列或特定基因的方法，因此又称做基因的体外扩增法.PCR扩增技术正如DNA自我复制的自然过程，其特异性依赖于与靶基因目标序列两端互补的寡核苷酸引物序列.PCR技术能快速简便特异地检测和扩增任何需要的目的基因或相关DNA序列片段，并能基于DNA细胞分子起始水平的目的基因扩增达到克级、微克、毫纳克的特异性DNA目的基因片段，正因如此，PCR（聚合酶链式反应）已经被应用于分子生物学的各个领域迅速而广泛的被采纳.随着PCR技术的广泛应用，早已成为了一项重要的“革命性的技术”，不仅推动了医学遗传与分子生物学领域的发展，而且在临床与其他诊断技术相结合，极大地提高了临床医学诊断技术.

5-脂氧合酶（5-lipoxygenase 5-LO）是花生四烯酸代谢途径中非常关键的一个酶，花生四烯酸的代谢产物白三烯（Leukotrienes LTs）可以引起支气管痉挛、气道变应性炎症和气道高反应性，其生物活性强烈、作用时间持久，是引起哮喘的主要炎性介质.5-LO基因含有14个外显子，mRNA全长为2568bp，文献[1-2]显示该酶基因的多态性可能与哮喘病相关联，其cDNA760位的G突变成A，760G>A位于第六个外显子中，在基因库中也有记载,其对应的254位的氨基酸由带负电荷的谷氨酸(E)突变成带正电荷的赖氨酸(K)，这一单核苷酸多态性（SNP）引起了电荷的改变对酶的功能或者该酶与其他酶的相互作用都有可能受影响.5-LO基因抑制剂是治疗哮喘的新方法以及治愈哮喘的有效药物，它的作用机理是通过抑制5-LO基因的作用以阻遏其下游产物的产生，通过检测哮喘病人的5-LO基因E254k突变位点，研究该位点突变与5-LO抑制剂的药物反应，对临床治疗哮喘意义重大.本文介绍了一种经济、简便、快速检测哮喘患者5-LO E254K的方法，因此值得推广.

2 研究对象和方法

2.1 研究对象

正常对照是无过敏史的正常人，哮喘患者是经临床诊断且知情同意后的自愿者.

2.2 试剂与仪器设备

引物是由北京赛百盛基因技术集团有限公司生物合成、外周血中提取基因组DNA试剂盒购自北京百泰克生物集团技术有限公司、红细胞裂解液购自北京索莱宝科技集团有限公司、琼脂糖购自西班牙原装进口、其它所需药品和试剂均为国内产品；电泳设备(北京六一仪器厂)、高速离心机、超微量分光光度计（NanoDrop 2000）、真空浓缩仪（VC-15SP）、全自动凝胶成像仪(Tocan240)、高压灭菌锅、低速离心机、涡旋混合仪、eppendorf移液器、PCR仪（ABI2720）等.

2.3 引物设计

表1-1 设计的引物

等位基因特异性PCR法是利用Taq酶缺乏3’-5’外切酶活性的特点，在突变型引物扩增正常DNA模板时，延伸反应会因磷酸酯键难于形成而不能进行，也就得不到特异长度的条带，从而表明模板DNA无此突变.反之，表明有突变产生.将突变型引物和非突变型引物分别用于同一DNA模板的扩增，判断有无特定位点基因的特定突变[3].根据这一原理针对野生型和突变型设计3’端的碱基，一般倒数第二位的碱基设计故意错配的碱基，用以提高引物的特异性[4].我们参考文献[5]设计的引物见表1-1.设计的对照用左侧引物为5LOEX8S，对照用右侧引物为5LOEX8A，PCR产物为600bp；用于检测5-LO野生型（Glu）的左侧引物为5-LO 254W，用于检测5-LO突变型（Lys）的左侧引物为5-LO 254M，共用的右侧引物为5-LO EX6A，PCR产物为301bp.

2.4 样本的采集与处理

收集外周血标本，提取基因组DNA作为扩增反应的模板，具体方法如下[6]

2.4.1 白细胞的分离：

血细胞中的红细胞没有细胞核，基因组DNA要在白细胞中提取，低渗溶血法，利用白细胞对低渗液的抗性差别很大，红细胞在0.2%NaCL溶液中极易破裂，待红细胞完全破坏后，离心得到白细胞沉淀.即3ml全血倒入10ml离心管（1500r,5min）;血浆移入2ml的离心管剩余加0.2%NaCl到10ml,混匀（2500r,5min），弃上清加 0.2%NaCl混匀(2500r,5min)弃上清，加1ml 0.2%NaCl吸打混匀，移入1.5ml离心管（1200r,1min）,吸上清并贴标签-20℃保存[7].

2.4.2 基因组DNA的提取：

将上述白细胞从冰箱中取出，按基因组DNA提取试剂盒的说明操作，最后加入100ulDNA溶解液，混匀后测基因组DNA的纯度和浓度.

2.5 PCR反应体系和条件

2.5.1 PCR反应体系

分A管和B管，分别加入野生型和突变型的引物，两管中均加入对照用一对引物和共用的右侧引物.反应体系中加入 PCR mix(北京百泰克公司)：25μl；引物 5LO EX8S和5LO EX8A（10μM）各 1μl；引物 5-LO 254W(A管)/5-LO 254M(B管)和 5LOEX6A（10μM）各 1μl；模板（100-150ng/μl）:1μl；灭菌水：20μl，总体系 50μl.

2.5.2 PCR反应条件

聚合酶链式反应技术是模拟生物体内DNA自我复制过程，包括三个步骤，即变性、退火、延伸.变性：94-95℃加热，使DNA双螺旋打开，便于引物结合；退火：40-70℃使引物与模板DNA序列互补，形成杂交链；延伸72℃下按照碱基互补配对原则，在ToqDNA聚合酶作用下将dNTP依次加引物的3’端，直到新的DNA双链形成，如此反复进行，经30个循环可获得230个拷贝数产物.本实验中采用以下反应条件见表1-2：95℃预变性5分钟，然后按95℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟循环30次，末次循环后72℃延伸10分钟，4℃保存.

表1-2 PCR反应条件

2.6 琼脂糖凝胶电泳

2.6.1 制备2%琼脂糖凝胶

首先称取琼脂糖2.0g，加入三角瓶中，相继再加1﹡TAE缓冲液100ml；然后放入微波炉加热，取出后再依次煮沸、2-3次震荡；制胶膜具、插好梳子；等到溶液胶冷却到60%左右后（注意不要过凉而发生凝固），将琼脂糖融化好后，慢慢倾入本实验的电泳槽，此时样品孔应在在阴极端；最后向电泳槽中加入1xTAE缓冲液，胶面页面高于1-2mm，琼脂糖凝胶有效范围如表1-3所示.

表1-3 琼脂糖凝胶与的DNA分子的有效分离范围

2.6.2 上样

取PCR产物10μL，将吸头垂直插入液面下，小心加入凝胶孔中；接通号电源，打开测试仪电源开关，直至出现气泡（铂金线为准）.

2.6.3 染色

凝胶结束后，将凝胶小心放入EB染液中浸泡30min,于Tocan240中观察并分析，最后将结果保存.

3 结果

3.1 基因组DNA的浓度与纯度测定结果

双击桌面NanoDrop2000软件按钮，选择应用Nucleic Acid;确定仪器是闭合状态；取2μLDNA溶解液点在微量基座上，放上下臂点Blank进行空白对照；每次测量完成都要用吸水纸擦干净.测量台及上方的侦测部位；在SampleID位置输入样品名称，取2μL混匀的样品点在测量基座上，放上下臂，按Measure进行测量，测量结果如表1-4所示：

表1-4 基因组DNA浓度和纯度测定

经检测后,OD260/280所有值都在1.80-2.0之间，则表明DNA的纯度较高，浓度平均为598.6ng/ul，说明基因组DNA提取质量较高，实验结果可信.

3.2 凝胶电泳结果

琼脂糖凝胶电泳：PCR扩增后取PCR产物10ul，进行2%的琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR扩增的结果,取5ulDNA markerI作为标记，条带分别为 600、500、400、300、200、100，见图1.

图1 等位基因特异性PCR法检测5-LO E254K电泳结果

第1泳道为marker,A管加的是野生型引物，B管加的是突变型引物，第2和3泳道为同一个模板，结果显示只有A管除了有内参照物条带外还有目的条带，而B管未出现目的条带说明为野生型GG；第4和5泳道为另一个模板，结果显示为A管和B管除了有内参照物条带外都出现了目的条带，说明是杂合突变型GA.

4 讨论

研究SNPs常用的方法有测序法、酶切法和等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)法.测序法的优点在于可以发现新的突变位点，当一个外显子中含有多个（5个以上）SNP位点时，采用测序法比较经济有效且直接.当已知突变位点正好处于酶切位点时可以采用酶切法.本文介绍了等位基因特异性PCR法快速检测5-LO基因E254K多态性的详细步骤，本研究用的AS-PCR技术检测重要的成败因素在于其引物设计，利用由北京赛百盛基因技术集团有限公司合成的引物和相关的试剂，较为简便地成功检测了5-LO E254K突变基因，用该方法可以直接扩增分型，跟测序法和限制性内切酶酶切法相比，具有经济、快速、简便、易行等特点.特别适用于大批样本单个位点的研究.

5-脂氧合酶是花生四烯酸代谢途径非常关键的一个酶，其代谢产物白三烯是引起哮喘发作的一个重要的炎性介质.治疗哮喘的新药5-脂氧合酶抑制剂就是通过抑制5-脂氧合酶的作用以阻止下游产物白三烯的大量生成.检测哮喘患者的5-LO E254K多态性，观察该多态性对5-脂氧合酶抑制剂的药物反应，对临床治疗哮喘有非常重要的意义.本文介绍了一种快速检测5-LO E254K多态性的方法，应用该方法可以快速直接进行分型，区分不同基因型的标志性条带都清晰可见，突变型和野生型条带都很清晰，没有杂带，减少了人为误差，电泳结果与测序结果完全吻合.我们经过大批量的实验已经摸索出了非常成熟的条件，可以用于临床快速检测5-LO E254K多态性.

5 前景与展望

随着传统PCR（聚合酶链式反应）技术及其衍生出来的技术方法和不断发展创新的新型PCR检测技术的出现，这些新技术已逐渐广泛应用到医学基因疾病诊断和治疗研究的各个领域.该技术与方法的不断完善和创新，必然会导致医学事业的蓬勃发展.同时对于临床医学来讲，PCR技术应用范围将不断的扩大和深入，PCR检测技术在检验、医学生物、诊断治疗和其他各个领域的应用都会发挥其重要的作用，例如在高通量的突变基因检测方面具有极其重要的地位.同时未来的PCR研究主要会致力于在疾病的基因诊断的方法改进上，以及整合其他技术应用，从而在未来临床医学领域和相关检测和治疗领域中产生质的飞跃，促进医学卫生事业出现令人期待的应用前景.而本研究对哮喘突变基因的检测方法作为PCR技术在医学领域研究的一部分值得探讨和推广.

〔1〕Chunying B，Eiko M，Hidenori O，et al．A novel polymorphism，E254K，in the 5-lipoxygenase gene associated with bronchial asthma[J]．Intern J Molec Med，2008，21:139-144．

〔2〕Bai C(白春英),Yu X,Yun R,Shi T,Zhang C,Zhou J,Sachurangui,Tong L,Li X,Gao L.Association of 5-lipoxygenase gene polymorphisms with bronchial asthma.Exp Ther Med.2012,4(6):967-971.

〔3〕李春晓，张晓龙，曹晓梅，等.特异性等位基因PCR扩增技术检测家蝇击倒抗性相关钠通道的基因突变[J].中国媒介生物学及控制杂志，2007，18（3）：255-256.

〔4〕徐克前.分子生物学检验技术实验指导[M].人民卫生出版社，2007.154-158.

〔5〕白春英，史铁伟，瑞云，等.等位基因特异性PCR法检测5-脂氧合酶基因多态性[J].山东医药杂志，2012，52（31）：28-29.

〔6〕白春英，周静,瑞云，等.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法[J].检验医学与临床,2010(17):1795-1798.

〔7〕吴晓东，张博文，王博楠，等.应用PCR技术扩增SRY基因检测性别[J].赤峰学院学报（自然科学版），2013，29(7)：138-141.