抗鼻咽癌质粒pFY转化和菌种筛选的研究*

翁闪凡，刘 娜，张晓林

(佛山科学技术学院医学院医学检验系，广东佛山 528000)

论著·基础研究

抗鼻咽癌质粒pFY转化和菌种筛选的研究*

翁闪凡，刘 娜，张晓林

(佛山科学技术学院医学院医学检验系，广东佛山 528000)

目的筛选携带抗鼻咽癌质粒pFY的稳定高产菌株。方法以CaCl2法制备大肠杆菌JM109感受态，将抗鼻咽癌质粒pFY转化JM109感受态，对琼脂平板上获得的菌落进行筛选，选出符合标准的单菌落为菌种，进行菌种稳定性实验。用质粒提取试剂盒检测质粒含量。将抗鼻咽癌质粒pFY转染到细胞CNE-2中，四氮唑蓝(MTT)比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。结果筛选得到菌株的培养液中质粒DNA含量为30 mg/mL，超螺旋DNA比例为92%。经电泳和酶切鉴定，该菌株的50子代所携带质粒与原代一致。质粒pFY对CNE-2细胞株生长有明显的抑制作用。结论成功筛选出携带抗鼻咽癌质粒pFY的稳定高产菌株，为大批量制备临床应用级质粒奠定了基础。

鼻咽肿瘤；感受态细胞；质粒；转化；筛选

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，其发病率居于头颈肿瘤发病率的首位。NPC具有罕见的地理和种族分布特征。在中国南方(广东、广西、湖南、福建和江西)，其发病率和病死率均居世界首位[1]。本实验室构建的质粒pFY是一种能在鼻咽癌细胞中高效特异表达靶基因的质粒，具有潜在的治疗鼻咽癌的应用前景。

目前，质粒DNA作为核酸疫苗和基因治疗载体越来越受到研究者的重视,国内外已有上千家研究机构进行相关的研究[2-3]。质粒DNA作为基因载体比较安全、使用方便，但其在靶细胞中基因表达效率低和持续时间较短，因此质粒介导的基因治疗要求反复给药并需大量药物级质粒DNA[4]。而筛选出高产优质的菌种是大批量制备质粒的首要步骤。通过实验，本文得到一种筛选携有pFY的高产优质菌株的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 酵母提取物(OXIOD)；胰蛋白胨(OXIOD)；氯化钠、琼脂粉和氯化钙(均为广州化学试剂厂AR级)；氨苄青霉素(鲁抗)；质粒提取试剂盒(Qiagen)；四氮唑蓝 (MTT)；脂质体转染试剂。恒温培养箱(上海精诚)；振荡培养箱(太仓华美HZQ-200)；核酸蛋白检测仪(eppendorf)；高速离心机(eppendorf);凝胶成像系统(法国VL公司)；无菌操作台(上海精诚)；9 cm培养皿(蜀牛)；50 mL或250 mL三角瓶(蜀牛)。抗鼻咽癌质粒pFY、大肠杆菌JM109、人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2分别为本实验室构建和保存。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌JM109感受态的制备(CaCl2法) (1) 将保藏的大肠杆菌JM109菌种，接入装有已冷却凝固灭菌LB琼脂培养基的培养皿中，涂布或画线使菌种在培养基生长出单菌落，将培养皿在恒温培养箱中倒置37 ℃ 培养16～20 h。(2)从生长有单菌落的培养平皿内，无菌挑取一个直径约为2～3 mm的单菌落。接入装有10 mL LB肉汤的50 mL灭菌三角瓶中，在摇床培养箱中，250 rpm，37 ℃培养9～10 h(菌体密度OD600为2.0，此时细菌处于对数生长中期)。(3)在装有 20 mL LB的50 mL灭菌三角瓶中，无菌接入OD为2.0的大肠杆菌JM109菌液0.2 mL。在摇床培养箱中，250 rpm，37 ℃培养2～2.5 h(菌体密度OD600为0.4)。(4)在室温条件下，将OD600为0.4的培养液以4 000 rpm离心5 min，弃上清液，收集菌体细胞；再加入10 mL 冰冷的0.1 M CaCl2溶液(已除菌)，并轻微摇匀。4 ℃ 4 000 rpm离心10 min，弃上清液，收集菌体细胞。加入0.8 mL(每25 mL培养液加入1 mL)冰冷的0.1 M的CaCl2溶液，并轻微摇匀。冰浴放置3 h，用4支已灭菌的1.0 mL EP管中无菌分装CaCl2菌体细胞液(0.2 mL/支)，备质粒转化使用。

1.2.2 抗鼻咽癌质粒pFY转化 (1) 将40 μg抗鼻咽癌质粒pFY无菌加入装有0.2 mL大肠杆菌JM109感受态的EP管中。轻柔混匀后，于冰浴静置40 min；冰浴好后，把EP管放于恒温水浴锅中，42 ℃静置水浴90 s；再及时把EP管迅速转移至冰浴2～3 min；向EP管中加入0.5 mL已灭菌的LB肉汤，37 ℃放置60 min，以使细菌细胞复原。(2)无菌取样0.1 mL质粒转化菌液，接入到装有凝固LB琼脂平板(含有50 ng/mL氨苄青霉素)的培养皿中进行涂布，另取0.1 mL无菌水涂布做空白对照组，将培养皿在恒温培养箱中倒置37 ℃ 培养16～20 h，观察平板菌落形态，要求每个平板含有菌落20～40 cfm，空白对照板菌落数为零。

1.2.3 菌种筛选 初筛：在培养好的平板中，无菌挑取单菌落20个，分别接入装有50 mL LB(含有50 ng/mL 氨苄青霉素)的250 mL 灭菌三角瓶中,并编1～20号，放入摇床培养箱中，250 rpm，37 ℃培养12 h，分别无菌取1 mL 菌液，用1 mL 的30%甘油在1.5 mL 的EP管中混合，编写与三角瓶对应的号码，标上日期，放在-20 ℃冰箱保存。同时分别检测菌液的OD600值和pH值，用试剂盒检测质粒含量。复筛：以质粒含量(mg/mL)及质粒含量比OD600值(mg/mL/OD)为指标，选取上述指标前10位的单菌落，分别从对应的甘油管保藏菌液中，取0.05 mL 接入装有50 mL LB(含有50 mg/mL 氨苄青霉素)的250 mL 灭菌三角瓶中(条件同上)培养10 h，如此摇床筛选反复几次，筛选出每次摇床培养中上述指标都最好的单菌落为菌种，并做稳定性实验。

1.2.4 菌种稳定性实验 将筛选出的菌种，以传代培养进行菌株产质粒稳定性的检测。从平板生长的菌落接入LB液体培养基中震荡培养12 h的菌液为第0代，再将以0代为菌种经过12 h摇床培养的菌液为第1代。如此依次接种传代摇床培养，分别为第1、2、3…50代。第0、第5、第10、第15、第20、第25、第30、第35、第40、第45、第50代取样检测OD600、pH，质粒含量和进行凝胶电泳成像。摇床培养条件为250 rpm，37 ℃培养12 h。

1.2.5 检测方法 菌体密度OD600值：以无菌水为空白样，在吸收波长600 nm处检测菌液吸收值,样品稀释至OD值为0.2～0.8 范围内；质粒含量(mg/mL)：取1 mL菌液，离心收集菌体细胞，用(QIAGEN Plasmid Mini Kit)公司质粒提取试剂盒检测质粒含量。琼脂糖凝胶电泳:1%的琼脂糖凝胶，电压75 V,时间40～60 min。通过凝胶成像系统分析质粒超螺旋比例。

1.2.6 细胞培养及转染 将CNE-2细胞株常规传代于RPMI-1640培养液中，取对数生长期细胞用于实验，按照转染试剂操作手册进行转染实验。

1.2.7 抗鼻咽癌质粒pFY对细胞CNE-2的生长抑制率 将质粒pFY转染到细胞CNE-2中，MTT比色法观察转染试剂及质粒载体对细胞生长增殖的影响。实验设未处理组、脂质体组、PFY/脂质体组，质粒浓度为2 mg/L，转染48 h后，每孔加入10 mg/L MTT 10 μL，培养4 h后，加二甲基亚砜100 μL，测定波长570 nm和630 nm处的吸光度A值。每组设4个平行孔，结果取平均值。细胞生长抑制率的计算公式为：(1-实验孔A值)/对照孔A值。

2 结 果

2.1 菌落筛选结果 在质粒转化、初筛过程中，通过电泳成像和质粒含量检测发现，挑选出的菌落产质粒能力有3种类型，第1种类型如图1中的样品1，其产质粒能力低，且质粒超螺旋比例低；第2种类型如图1中样品2，其产质粒能力好，且质粒超螺旋比例高;第3种类型如图2中样品3，其产质粒能力好，但质粒超螺旋比例较低。具体实验结果如表1所示。

图1 转化后菌种携带的质粒

表1 3种不同类型菌落的产质粒能力的比较

在初筛的试验结果中，为了得到具有高产优质能力的菌种，以第2种类型菌落进行复筛。经过3轮以上的复筛，在以LB为培养基，37 ℃、250 rpm振摇培养12 h，最终筛选出产质粒含量为30 mg/mL,近似拷贝数为6.5 mg/mL/OD，超螺旋比例为92%的菌株。

2.2 稳定性实验结果 以筛选出具有高产优质的菌株为母菌，扩增培养，甘油保种，建立种子库；并做菌种传代的质粒稳定性实验，电泳检测结果如图2，图3。图2为菌种传代后产质粒能力的稳定性实验结果，分别在菌种摇床培养的第1、2、5、10、15、20、30、40、50代取样，提取质粒，进行电泳检测和分析，结果为：菌液质粒含量为(30.0±0.1)mg/mL,近似拷贝数为(6.50±0.02)mg/L/OD，超螺旋比例为(92.0±0.1)%。同时取PCR扩增的pFY质粒和该菌株的第0、25、50代菌提取的pFY质粒进行Kpn I酶切，电泳检测结果如图3所示，PCR扩增的pFY质粒和该菌种产的质粒酶切片段一致，提示了该菌种携带的pFY质粒是正确的。以上结果说明筛选出的菌株从0代到50代产质粒能力没退化，质粒pFY为该菌株稳定携带。因此利用该菌株作为母菌，进行扩增培养，建立了种子库，可用于发酵等其他实验或生产。

2.3 抗鼻咽癌质粒pFY对细胞CNE-2的生长抑制率 处理组、脂质体组、PFY/脂质体组的MTT结果见表2。

图2 质粒稳定性的电泳图

图3 pFy质粒的Kpn I酶切

表2 脂质体介导的质粒PFY对细胞CNE-2生长抑制作用

3 讨 论

在质粒转化实验中，目前国内外已有不少相关方面研究。Zhu等[9]通过上调LMP1 DNA内的miR-155显示有助于增加鼻咽癌细胞的增殖，另外还有通过磁性纳米复合耦合物吸附质粒方法提高基因转染效率，以获得更高效的扩增目标[10]。而本研究通过将质粒pFY转染到细胞CNE-2方法来达到扩增质粒的目标。

在本研究中，其中用CaCl2法制备大肠杆菌JM109感受态过程中，笔者发现国外CaCl2试剂，其最佳有效浓度是0.07 M，或者采用磷酸钙[11]进行制备。而国产(如广州化学试剂厂)的CaCl2试剂用量为0.1 M。但CaCl2浓度超过上述量时，会使菌体凝结，降低质粒转化效率，与文献[5-6]报道一致。根据文献[7]报道和作者的经验，每OD菌体感受态的制备，加入质粒量至少为0.5 μg，才能保证每个菌体细胞进入质粒数是充足的，以便提高质粒的产量。

而在质粒转化后，37 ℃培养16 h生长在琼脂平板上的菌落直径多为2～3 mm。挑选菌落时，应选择分布均匀，大小一致，边缘整齐的菌落进行摇床培养筛选。但实验过程中发现，质粒含量高的菌株其对应菌落直径反而相对较小，如直径1～2 mm菌落质粒的含量一般比直径2.5～3 mm菌落的高5 mg/mL,其超螺旋比例也较高。这可能是因为菌体细胞内要携带的外源质粒越多,其质粒合成代谢的负担也就越大，导致菌体生长的速率就比较慢，在琼脂平板上生长形成的菌落也就越小[8]。

本研究成功筛选出产质粒含量高及超螺旋比例高的菌株，这种方法对其他的质粒转化和菌种筛选有较好的借鉴作用，能大幅度地提高菌种携带质粒能力，为发酵、提取质粒及其他相关研究工作奠定坚实的基础。

[1]贾卫华，曾益新．鼻咽癌易感基因研究[J]．肿瘤杂志，2004，19(4):270-272．

[2]Yang SS,Sun J,Liao XP，et al．Co-location of the erm(T) gene and blaROB-1 gene on a small plasmid in Haemophilus parasuis of pig origin[J]． Antimicrob Chemother，2013,4(11):110-115．

[3]Sonnevend A,Al Baloushi A,Ghazawi A． Emergence and spread of NDM-1 producer Enterobacteriaceae with contribution of IncX3 plasmids in the United Arab Emirates [J]．Med Microbiol,2013,4(11):206-210．

[4]Zhu JH,Yuan Y,Li D,et al.Targeting nuclear factor-κB suppresses the negative effect of toll-like receptor 4 signaling on antimetastasis therapy based on targeting αvβ3 [J].Cancer Sci,2012,103(7):1319-1326.

[5]孟玲,谭德勇,王焕校．CaCl2法质粒转化最佳条件的探讨[J].云南大学学报：自然科学版,1996,18(2):106-108．

[6]王世伟,李旭业,张伟伟．优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究[J]．齐齐哈尔大学学报,2009,25(3)：86-90．

[7]王园园,蔡仕英,姚志建．几种制备感受态细胞及质粒转化方法的比较[J]．军事医学科学院院刊，1999，15(2)：152-155．

[8]Roychoudhury A,Basu S,Sengupta DN． Analysis of comparative efficiencies of different transformation methods of E.coli using two common plasmid vectors[J]． Indian J Biochem Biophys,2009,46(5):395-400.

[9]Zhu X,Wang Y,Sun Y,et al.MiR-155 up-regulation by LMP1 DNA contributes to increased nasopharyngeal carcinoma cell proliferation and migration[J].Eur Arch Oto-Rhino-Laryng,2014,271(7):1939-1945.

[10]Liu T,Ma D,Ke B,et al.Gene transfection of magnetic nanocomposite loading plasmid modified by folic acid targeted to nasopharyngeal carcinoma[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2014,94(10):772-775.

[11]Liu T,Tang A,Zhang G,et al.Calcium phosphate nanoparticles as a novel nonviral vector for efficient transfection of DNA in cancer gene therapy[J].Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals,2005,20(2):141-149.

Study on transformation of anti-nasopharyngeal carcinoma plasmid pFY and bacterial strains screening*

WengShanfan,LiuNa,ZhangXiaolin

(DepartmentofLaboratoryMedicine,MedicalCollege,FoshanUniversity,Foshan,Guangdong528000,China)

ObjectiveTo screen the stable high-producing strains carrying anti-nasopharyngeal carcinoma(NPC) plasmid pFY.MethodsCompetent E.coli JM109 was prepared by the CaCl2 method and transformed with anti-NPC plasmid pFY.The bacterial colonies obtained from the agar plate were screened for selecting the single colony conforming to the standards as the bacterial strain and conducting the stability test.The plasmid content was detected by the plasmid extraction reagent kit.Anti-NPC plasmid pFY was transfected into nasopharynegal carcinoma cell line CNE-2.The influence of transfection reagent and the plasmid vector on the cell proliferation was detected by MTT.ResultsThe DNA concentration of plasmids in the culture solution of bacterial strain obtained by screening was 30 mg/mL.The proportion of supercoiled DNA was 92%.The identification of electrophoresis and restriction enzymes showed that the plasmids harbored in the 50th progeny of this strain were same as those in the primary.Plasmid pFY had the evident inhibiting effect on the growth of CNE-3 cell line.ConclusionThe stable high-producing strains of E.coli carrying anti-NPC plasmid pFY is successfully screened out,which lays the foundation for large-scale preparation of plasmid pFY for clinical utility.

nasopharyngeal neoplasms；competent cells;plasmid;transformation;screening

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.26.004

广东省医学科研基金资助项目(A2013687)；广东省大学生创新创业训练计划项目(1184713046)

：翁闪凡(1975-)，本科，高级实验师，主要从事鼻咽癌的基础研究。

R739.6

A

1671-8348(2015)26-3613-03

2015-04-08

2015-06-02)