HPLC法测定刺五加、五加皮与红毛五加皮中3种成分的含量

任晋，廖娴，谢镇山，叶家宏，黄月纯

(1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州510006；2.广州中医药大学 第一附属医院，广东广州510405)

HPLC法测定刺五加、五加皮与红毛五加皮中3种成分的含量

任晋1，廖娴2，谢镇山1，叶家宏1，黄月纯2

(1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州510006；2.广州中医药大学 第一附属医院，广东广州510405)

目的建立刺五加、五加皮、红毛五加皮中原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸的质量分数测定方法。方法采用HPLC法，色谱柱为Kromasil C18色谱柱；流动相为乙腈-0.1%(体积分数)H3PO4溶液，梯度洗脱；检测波长为270 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃。结果刺五加中原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸达到基线分离，线性关系良好(r≥0.999 9)，平均加样回收率分别为98.7%、99.7%、101.0%，RSD均小于3.0% (n＝6)。刺五加、五加皮、红毛五加皮中原儿茶酸质量分数分别为0.022 5～0.028 7、0.076 3～0.132、0.013 8～0.071 2 mg/g；紫丁香苷质量分数分别为0.445～0.616、0.023 8～0.025 9、0.037 3～0.069 3 mg/g；绿原酸质量分数分别为1.834～2.169、0.659～0.713、0.372～0.709 mg/g。刺五加中紫丁香苷、绿原酸质量分数最高，其中紫丁香苷约为五加皮、红毛五加皮中质量分数的7～25倍，绿原酸约为五加皮、红毛五加皮中质量分数的3～5倍；而原儿茶酸在五加皮中质量分数最高，其次为红毛五加皮、刺五加。结论该方法灵敏、可靠，可用于刺五加、五加皮和红毛五加皮类药材质量控制的参考。

刺五加；五加皮；红毛五加皮；原儿茶酸；紫丁香苷；绿原酸；高效液相色谱法

剌五加为五加科植物刺五加 Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根、茎及根茎，味辛、微苦，温。益气健脾、补肾安神，用于脾肺气虚、体虚乏力、食欲不振、肺肾两虚等证[1]192。2010年版《中国药典》以紫丁香苷(刺五加苷B)质量分数作为刺五加主要质量控制指标。文献研究表明刺五加尚含有绿原酸、原儿茶酸等主要活性成分[2-3]。传统药用五加皮品种较混乱[4]，2010年版《中国药典》收载的五加皮为五加科植物细柱五加Acanthopanax gracilistyl W.W.Smith的干燥根皮(又名南五加皮)[1]61。此外，还有红毛五加皮，为五加科红毛五加Acanthopanax giraldii Harms密生刺毛的茎皮，因主产地为四川又名川加皮，收载于《四川省中药材标准》[5]。因五加皮各地使用习惯差异较大，仍有将红毛五加皮作五加皮入药，或将刺五加与红毛五加皮混为一体，也作五加皮入药，导致目前市售五加皮伪劣混用现象极为严重，影响了临床疗效。据文献报道，五加皮含原儿茶酸[6]、绿原酸[7]、紫丁香苷[8]等成分，红毛五加亦含有绿原酸[9]、紫丁香苷[10]、原儿茶酸[11]等成分，尚未见同时测定上述3种成分以评价刺五加、五加皮、红毛五加皮质量差异的报道。本研究采用高效液相色谱法(HPLC法)测定，同时比较刺五加、五加皮、红毛五加皮中紫丁香苷、绿原酸、原儿茶酸的质量分数差异，为这3种药材的成分及质量分析提供参考依据。

1 仪器与试药

药材分别购于广东多家药材公司与药店(见表1)，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定，分别为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根、茎及根茎，五加科植物细柱五加Acanthopanax gracilistyl W.W. Smith的干燥根皮以及五加科红毛五加Acanthopanax giraldii Harms的干燥茎皮；原儿茶酸对照品(批号为:110809-200503)，绿原酸对照品(批号为:0753-200111)均购自中国药品生物制品检定所；紫丁香苷对照品(批号为:111574-200603)购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，Merk公司；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸对照品、紫丁香苷对照品、绿原酸对照品适量，精密称定，加80%(体积分数，下同)甲醇制成每1 mL含原儿茶酸55.0 μg、紫丁香苷100 μg、绿原酸306 μg的混合对照品溶液，即得。

表1 12批样品的来源Table 1 The sources of 12 batches of samples

2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过4号筛)约1.0 g，精密称定，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，超声处理45 min，用80%甲醇补足减失的质量，滤过。滤液减压蒸至近干，残渣加甲醇溶解，置2 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相为乙腈(A)-0.1%(体积分数)H3PO4(B)，梯度洗脱:0～8 min，14%A→16%A，8～15 min，16%A→18%A，15～30 min，18%A→20%A，30～40 min，20%A→100%A，40～50 min，100%A，50～60 min，100%A→14%A；检测波长为270 nm；柱温为30℃。分别精密吸取混合对照品、供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，依法测定。结果表明3种成分的色谱峰分离度符合要求。见图1。

图1 刺五加(A)、五加皮(B)、红毛加皮(C)和混合对照品(D)溶液的HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis(A)，Acanthopanacis Cortex(B)and Acanthopanax giraldii Cortex(C)and mixed reference substances(D)

2.4 线性关系的考察

分别精密吸取原儿茶酸对照品溶液(每1 mL中含原儿茶酸0.550 mg)、紫丁香苷对照品溶液(每1 mL中含紫丁香苷0.496 mg)及绿原酸对照品溶液(每1 mL含绿原酸2.511 mg)各0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mL，置5 mL容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液5 μL，按“2.3”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。以进样量为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，结果原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸的回归方程分别为:Y ＝5.567 4×103X－11.717(r＝1.000 0)、Y＝2.398 3× 103X－0.586 1(r＝0.999 9)、Y＝8.596 2×102X＋19.245 (r＝0.999 9)，原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸对照品分别在0.011 0～0.550，0.009 92～0.496，0.050 2～2.511 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

分别精密吸取原儿茶酸对照品、紫丁香苷对照品、绿原酸对照品溶液5 μL，按“2.3”项下方法连续进样6次，结果原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸峰面积的RSD值分别为0.89%、0.55%、0.64%，表明方法的精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液5 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，按“2.3”项下方法测定，结果原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸峰面积的RSD值分别为0.61%、0.74%、0.93%，表明供试品溶液在24 h稳定。

2.7 重复性试验

取同一份样品(CWJ-1)6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法进样分析，计算3种成分的质量分数，结果原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸的平均质量分数分别为0.027 0、0.605、1.946 mg/g，RSD分别为1.06%、0.92%、0.82%。

2.8 加样回收率试验

取已知质量分数的同一批样品(CWJ-1)粉末6份，约0.5 g，精密称定，分别精密加入原儿茶酸对照品溶液(质量浓度为7.2 μg/mL)、紫丁香苷对照品溶液(质量浓度为103 μg/mL)、绿原酸对照品溶液(质量浓度为195 μg/mL)各2、3、5 mL，再精密加入80%甲醇15 mL，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法测定并计算加样回收率，结果表明加样回收率良好。见表2。

2.9 样品的测定

分别精密吸取原儿茶酸对照品、紫丁香苷对照品、绿原酸对照品溶液及供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪中，按“2.3”项下方法测定峰面积，按外标法计算样品中3种成分的质量分数，见表3。

3 讨论

本研究分别考察了60%(体积分数)乙醇、60% (体积分数)甲醇、80%(体积分数)甲醇、甲醇提取的效果，结果80%甲醇的提取效果最好；筛选了30、45、60 min不同超声处理时间，结果超声处理45 min可基本提取完全；比较超声处理1、2次的结果，发现超声1次已基本提取完全。最终确定采用80%甲醇超声处理1次的提取方法。

表2 刺五加中3种主要成分的加样回收率试验结果Table 2 Recovery results of the three constituents of Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis(n＝6)

表3 12批样品中原儿茶酸、紫丁香苷、绿原酸的质量分数测定结果Table 3 Mass fraction results of protocatechuic acid，syringin and chlorogenic acid in 12 batches of samples(n＝2)

紫丁香苷又称刺五加苷B，是刺五加的主要有效成分，文献报道具有很强的止血作用[12]以及降血脂[13-14]、抗氧化[15]等药理作用；绿原酸具有较强的生物活性，有广泛的抗菌作用[16]；原儿茶酸具有抗菌、祛痰、平喘作用[17-18]。紫丁香苷、绿原酸和原儿茶酸都具有较强生理活性，是刺五加、五加皮、红毛五加皮发挥药效作用的主要成分，故确定了将这3种成分质量分数测定作为刺五加、五加皮、红毛五加皮质量比较的指标。方法学考察表明本方法简便、稳定、重复性好。

本试验6批刺五加、3批五加皮和3批红毛五加皮中3种成分的质量分数测定结果表明，刺五加中紫丁香苷、绿原酸质量分数最高，其中紫丁香苷质量分数约为五加皮、红毛五加皮中的7～25倍，绿原酸质量分数约为五加皮、红毛五加皮中的3～5倍；而五加皮中原儿茶酸质量分数最高，其次为红毛五加皮、刺五加。各有效成分质量分数的高低对3种药材的药理作用有较大影响，故3种药材在临床上具有不同的功效作用，用于相应的病症。

刺五加主要用于治疗脾肾阳虚、体虚乏力、食欲不振、腰膝酸痛、失眠多梦等症，五加皮主要用于风湿痹病、筋骨痿软、行迟、水肿、脚气，两者功效完全不同。红毛五加皮(川加皮)功效与五加皮功效大致相同，但没有利水消肿的功效，与后者不能混用，更不能认为它就是刺五加。本方法可以准确鉴别刺五加，并与五加皮、红毛五加皮相区别。3种活性成分质量分数的差异可为3种药材的质量评价提供依据，亦为临床用药的指导提供试验参考。

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(责任编辑:刘晓涵)

Determination of three constituents in Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex by HPLC

REN Jin1，LIAO Xian2，XIE Zhenshan1，YE Jiahong1，HUANG Yuechun2
(1.First School of Clinic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.The first Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

ObjectiveTo establish a determintation method for protocatechuic acid，syringing and chlorogenic acid in Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex by HPLC.MethodsHPLC method was performed with the Kromasil C18column.The acetonitrile-0.1%phosphoric acid(gradient elution)was employed as a mobile phase，and the detection wavelength was 270 nm.Column temperature was 30℃，and the flow rate was 1.0 mL/min.ResultsBaseline separation was obtained and the linear relationship was good(r≥0.999 9)for the three constituents.The average recoveries of protocatechuic acid，syringin，and chlorogenic acid were 98.7%，99.7%and 101.0%，and their RSD were below 3.0%(n＝6).In Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex，the content of protocatechuic acid was 0.022 5－0.028 7，0.076 3－0.132，0.013 8－0.071 2 mg/g，and the content of syringin was 0.445－0.616，0.023 8－0.025 9，0.037 3－0.069 3 mg/g，and that of chlorogenic acid was 1.834－2.169，0.659－0.713，0.372－0.709 mg/g，respectively.The contents of syringin and chlorogenic acid in Acanthopanax senticosiRadix et Rhizoma seu Caulis were the highest，in which that of syringin was as about 7－25 times high as canthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex while that of chlorogenic was as 3－5 times.The content of protocatechuic acid in Acanthopanacis Cortex was the highest，followed by Acanthopanax giraldii Cortex and Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis.ConclusionThe method is sensitive，reliable and available for the quality control of Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis，Acanthopanacis Cortex and Acanthopanax giraldii Cortex.

Acanthopanax senticosi Radix et Rhizoma seu Caulis；Acanthopanacis Cortex；Acanthopanax giraldii Cortex；protocatechuic acid；syringin；chlorogenic acid；HPLC

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.010

1006-8783(2015)05-0602-05

2015-06-15

任晋(1990—)，男，2013级硕士研究生，Email:18620163890＠163.com；通信作者:黄月纯(1968—)，女，主任中药师，硕士生导师，从事中药质量标准研究与指纹图谱分析，Email:huangyuechun＠163.com。

时间:2015-10-19 15:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151019.1505.004.html