熟地黄对急性血瘀症大鼠血液流变性和凝血功能的改善作用

刘若轩，李常青，邓志军，郭洁文，李丽明，齐耀群，李阿荣

(1.广州市中医医院药学部，广东广州510130；2.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405)

熟地黄对急性血瘀症大鼠血液流变性和凝血功能的改善作用

刘若轩1，李常青2，邓志军1，郭洁文1，李丽明1，齐耀群1，李阿荣1

(1.广州市中医医院药学部，广东广州510130；2.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405)

目的研究熟地黄水提物对急性血瘀症大鼠血液流变性和凝血功能的改善作用。方法以肾上腺素结合冰水浴建立大鼠急性血瘀症模型，给予不同剂量的熟地黄水提物，测定血液流变学及凝血功能的相关指标。结果与模型组比较，大鼠给予熟地黄水提物中、高剂量组能显著降低血液流变学相关指标，延长凝血酶时间、凝血活酶时间和凝血酶原时间，降低纤维蛋白原含量。结论熟地黄水提物通过降低红细胞压积和红细胞沉积、缩短血小板聚集时间、延长凝血酶时间和降低纤维蛋白原含量，改善急性血瘀症大鼠的血液流变性和凝血功能。

熟地黄；血瘀；血液流变性；凝血功能

脉复生是广州市中医医院研制并用于治疗血栓闭塞性脉管炎(TAO)的特色中药制剂，临床实践与既往药效试验均证实其对TAO效果显著[1-2]。研究[3]发现脉复生中的熟地黄成分具有抗炎作用，应与其阻断ERK1/2和NF-κB的信号通路、促进活化的巨噬细胞炎症介质的产生有关。本研究通过大剂量皮下注射肾上腺素结合冰水浴建立大鼠急性血瘀症模型，观察熟地黄水提物对模型大鼠血液流变性及凝血功能的影响，为阐明脉复生的药效物质基础及作用机制提供科学依据。

1 材料

1.1 试药

熟地黄，购于广州至信药业有限公司，批号150101，经广州中医药大学李常青研究员鉴定为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)经炮制加工而成，符合《中华人民共和国药典》(2010 版)项下规定；盐酸肾上腺素注射液，无锡济民可信禾药业股份有限公司，批号130630；阿司匹林肠溶片，河南天地药业股份有限公司，批号140205；枸橼酸钠，天津富宇化学试剂有限公司，批号03121201。

1.2 试剂

凝血酶时间(TT)试剂盒、凝血活酶时间(APTT)试剂盒、凝血酶原时间(PT)试剂盒、血浆纤维蛋白原(Fib)试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，余为市售分析纯。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠60只，雄性，体质量180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2013-0020。

1.4 仪器

LG-PABER-1型血小板聚集凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器公司)；Coulter-TT血常规测定仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；LBY-BX2红细胞变形仪(北京普利生仪器有限公司)；LG-R-80B型血液黏度仪、EHK-40红细胞沉降压积仪(天津市亚坤电子科技发展有限公司)；LBY-N6C全自动血液黏度仪(北京普利生仪器有限公司)；KDC-220HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司)。

2 方法

2.1 熟地黄水提物的制备

将熟地黄适量加3倍量水浸泡后常规煎煮2次，合并滤液，浓缩至含生药1 g/mL的供试药液，4℃保存备用。

2.2 分组给药

60只SD大鼠随机分为6组:空白对照组(等容积生理盐水)、模型组(等容积生理盐水)、阳性对照组(阿司匹林肠溶片0.1 g/kg)、熟地黄水提物低、中、高剂量组(按生药量计分别为1、2、4 g/kg)。2.3 大鼠急性血瘀证模型的制备[4]

大鼠给予盐酸肾上腺素注射液0.8 mg/kg，共2次，间隔时间为4 h。第1次皮下给予盐酸肾上腺素注射液0.8 mg/kg 2 h后，将大鼠置于0～2℃冰水浴中游泳4 min，造成大鼠急性血瘀症模型。第2次皮下注射盐酸肾上腺素后大鼠禁食不禁水，12 h后腹主动脉取血测血液流变学和凝血功能相关指标。

2.4 红细胞沉降率及红细胞压积测定

10%(φ)水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，以3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝，吸取1 mL全血置于压积管中静置1 h并读数记录红细胞沉降率(ESR)，然后12 000 r/min离心10 min，读数记录红细胞压积(HCT)。

2.5 全血黏度和血浆黏度的测定

取枸橼酸钠抗凝血0.8 mL，血浆使用LG-R-80B电脑血液黏度测试仪测定全血黏度(WBV)；另取全血于3 000 r/min离心15 min，吸取血浆，使用LG-R-80B电脑血液黏度测试仪测定血浆黏度。

2.6 血小板凝聚率(PAR)测定

取枸橼酸钠抗凝血2 mL，1 000 r/min离心10 min，制备富血小板血浆，再以3 500 r/min离心10 min，制备贫血小板血浆，调节血小板密度约2.5× 108/mL，以终浓度5 μmol/L的ADP为血小板凝聚诱导剂，采用比浊法于37℃测定1、5 min血小板凝聚率及5 min内血小板最大凝聚率，按下列公式计算血小板聚集抑制率:血小板聚集抑制率＝(模型组血小板聚集率—给药组血小板聚集率)/模型组血小板聚集率×100%。

2.7 TT、APTT、PT和Fib含量的测定

取枸橼酸钠抗凝1 mL，3 500 r/min离心15 min，取上层血浆，按试剂盒说明方法于37℃测定APTT、TT、PT和Fib的含量。

2.8 数据处理

使用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，实验数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠HCT和ESR的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠的HCT和ESR明显增加(P＜0.01)，提示造模成功；与模型组比较，熟地黄水提物低、中、高剂量组均可显著降低HCT (P＜0.05或P＜0.01)，中、高剂量组能显著降低ESR (P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

3.2 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠全血黏度和血浆黏度的影响

如表2所示，与空白对照组比较，模型组全血测定切变率在200、100、50、1/s下的全血黏度及血浆黏度明显增高；与模型组比较，熟地黄水提物中、高剂量均可显著降低上述各切变率下的全血黏度及血浆黏度。

3.3 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠PAR的影响

如表3所示，与空白对照组比较，模型组大鼠的PAR明显增加；与模型组比较，熟地黄水提物中、高剂量组均可显著降低PAR。

3.4 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠TT、APTT、PT和Fib含量的影响

如表4可见，与空白对照组比较，模型组的TT、APTT、PT显著缩短，Fib含量显著升高；与模型组比较，熟地黄水提物中、高剂量组均能显著延长TT、APTT、PT，Fib含量显著降低。

表1 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠红细胞压积和红细胞沉降率的影响Table 1 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on haematocrit and erythrocyte sedimentation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表1 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠红细胞压积和红细胞沉降率的影响Table 1 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on haematocrit and erythrocyte sedimentation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

与空白对照组比较:∗∗P＜0.01；与模型组比较:＃P＜0.05，＃＃P ＜0.01。

组别 剂量/ (g·kg－1) ESR/ (mm·h－1) HCT/%空白对照组 － 57.2±1.24 0.32±0.14模型组 － 62.4±0.65∗∗0.89±0.19∗∗阿司匹林组 0.1 57.7±0.11＃＃0.41±0.05＃＃熟地黄水提物低剂量组 1 61.2±0.99 0.77±0.11＃中剂量组 2 60.2±0.24＃0.62±0.06＃＃高剂量组 4 58.3±0.39＃＃0.55±0.17＃＃

表2 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠全血黏度和血浆黏度的影响Table 2 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on whole blood viscosity and blood plasma viscosity in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表2 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠全血黏度和血浆黏度的影响Table 2 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on whole blood viscosity and blood plasma viscosity in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

与空白对照组比较:∗∗P＜0.01；与模型组比较:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别 剂量/ (g·kg－1)全血黏度/(mPa·s) 200/s 100/s 50/s 10/s血浆黏度/(mPa·s) 50/s空白对照组 － 3.6±0.03 3.9±0.27 5.3±0.14 22.1±1.42 1.32±0.09模型组 － 4.9±0.34∗∗5.2±0.17∗∗7.1±0.32∗∗29.7±0.96∗∗1.63±0.17∗∗阿司匹林组 0.1 3.8±0.0.15＃＃4.1±0.09＃＃5.6±0.25＃＃23.2±0.79＃＃1.36±0.11＃＃熟地黄水提物低剂量组 1 4.8±0.21 4.9±0.12＃6.9±0.41 27.2±1.13＃1.59±0.08＃中剂量组 2 4.5±0.19＃＃4.6±0.26＃＃6.6±0.37＃25.4±1.21＃＃1.45±0.05＃＃高剂量组 4 4.2±0.07＃＃4.3±0.31＃＃6.0±0.08＃＃23.9±2.32＃＃1.37±0.02＃＃

表3 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠PAR的影响Table 3 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on platelet aggregation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表3 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠PAR的影响Table 3 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on platelet aggregation rate in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

与空白对照组比较:∗∗P＜0.01；与模型组比较:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别 剂量/ (g·kg－1) PAR/% 1 min 5 min凝聚抑制率/%空白对照组 － 20.2±2.37 21.7±1.94 －模型组 － 39.4±4.92∗∗37.4±2.15∗∗－阿司匹林组 0.1 25.7±3.19＃＃22.1±1.36＃＃49.9熟地黄水提物低剂量组 1 37.1±4.32 36.3±2.91 11.7中剂量组 2 35.6±1.96＃31.2±2.25＃＃24.2高剂量组 4 31.9±3.21＃＃28.9±1.72＃＃31.9

表4 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠TT、APTT、PT及Fib的影响Table 4 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on thrombin time，the activated partial thromboplastin time，prothrombin time and fibrinogen in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

表4 熟地黄水提物对急性血瘀大鼠TT、APTT、PT及Fib的影响Table 4 Effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on thrombin time，the activated partial thromboplastin time，prothrombin time and fibrinogen in acute blood-stasis rats(±s，n＝10)

与空白对照组比较:∗∗P＜0.01；与模型组比较:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别 剂量/(g·kg－1) t(TT)/s t(APTT)/s t(PT)/s ρ(Fib)/(g·L－1)空白对照组 － 32.1±2.35 23.1±2.19 19.6±1.27 3.2±0.21模型组 － 24.7±1.32∗∗15.4±1.72∗∗12.3±1.32∗∗8.5±0.32∗∗阿司匹林组 0.1 29.2±0.97＃＃21.9±2.21＃＃17.9±1.25＃＃4.1±0.10＃＃熟地黄水提物低剂量组 1 25.5±2.85 16.1±0.97 13.7±0.23 8.2±0.23中剂量组 2 26.3±0.69＃17.4±1.02＃15.2±0.21＃7.1±0.42＃高剂量组 4 27.1±1.07＃19.2±2.12＃＃16.8±0.19＃6.2±0.65＃＃

4 讨论

血瘀主要是指各种致瘀因素，如气滞、气虚、痰凝、寒凝、血热和外伤等导致血行不畅、脉道壅塞而引起的病证，同时伴有全血黏度、红细胞压积升高、体外血栓形成的干湿量及长度增加，抑或影像学显示血管狭窄、闭塞或血流阻滞、血小板聚集性或血液流变性等理化指标异常提示循环瘀滞。血瘀证动物模型的建立一般采取仿照病因病机造模以及重复病理过程造模[5]。本实验仿气滞所致血瘀，根据人在暴怒时机体分泌大量肾上腺素的特点，给予大鼠高剂量肾上腺素模拟暴怒状态，后以冰水浸泡模拟寒邪侵袭，使机体迅速复制成浓、黏、凝、聚状态的血瘀证模型，结果可见模型大鼠的血液流变性等理化指标异常，提示循环瘀滞，再次体现了该证的临床表征[6]。

研究[7-8]证实血液流变性及凝血功能的异常是急性血瘀症的重要病理表现，其主要影响因素是Fib升高引起分子间牵连增大了血液黏度，而桥联作用又进一步增高红细胞的聚集性，加重血液黏度。血液流变性的改变在TAO及周围血管闭塞性病变中作用重要，APTT、PT和TT是检测内、外源性凝血和凝血共同通路变化的主要筛选指标，其中TT与Fib呈负相关，TT缩短，Fib含量相应升高。

熟地黄是我院院内制剂脉复生合剂的主要成分，具有活血化瘀而不伤血的功效，主要应用于免疫和心血管系统，具有抗氧化、增强免疫力、促进造血、抗突变等作用[9]。本研究结果发现熟地黄水提物中、高剂量组可降低红细胞聚集及红细胞压积，推测应与其抑制血小板凝聚率、延长凝血酶时间、降低纤维蛋白原的含量以改善血浆黏度有关。下一步将从其改善血液流变性及凝血功能的分子机制方面进行深入研究，为阐明脉复生的药效物质基础及治疗作用机制、提高用药的安全性提供科学依据。

[1]李顺宁.脉复生对动脉硬化闭塞症患者血脂及炎症细胞因子的影响[J].云南中医中药杂志，2011，32(11):19-21. [2]杜猛，尹红.脉复生对脉管炎患者免疫功能的调节作用[J].湖北中医杂志，2012，34(5):46-47.

[3]HAN Yunkyung，JUNG H W，LEE J Y，et al.2，5-Dihydroxyacetophenone isolated from Rehmanniae Radix Preparata inhibits inflammatory responses in lipopolysaccharidestimulated RAW264.7 macrophages[J].J Med Food，2012，15 (6):505-510.

[4]李伟霞，黄美艳，唐于平，等.大鼠急性血瘀模型造模方法的研究与评价[J].中国药理学通报，2011，27(16):1761-1764.

[5]郭强中，李云英.血瘀证研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2012，14(8):45-50.

[6]仇锦春，廖清船，张永，等.香丹注射液对急性血瘀模型大鼠血液流变性及血小板聚集的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(4):137-139.

[7]张可，马旭，韩淑燕，等.人参总皂苷与丹参总酚酸配伍对急性血瘀大鼠血液流变性的改善作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2012，26(5):641-645.

[8]蒋品，肖春洁.凝血项中纤维蛋白原和凝血酶时间检测结果相关性的分析[J].实用医技杂志，2008，15(2):189-190.

[9]李鹏飞，苗明三.熟地黄的现代研究及应用现状分析[J].中医学报，2014，29(2):252-254.

(责任编辑:幸建华)

LIU Ruoxuan1，LI Changqing2，DENG Zhijun1，GUO Jiewen1，LI Liming1，QI Yaoqun1，LI Arong1
(1.Department of Pharmacy，Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China；2.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

ObjectiveTo study the effect of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae on hemorheology and coagulation in acute blood-stasis rats.MethodsModel rats with acute blood-stasis were established by epinephrine combined with ice water bath，and the parameters of hemorheology and coagulation were measured after given different doses of the aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae.ResultsCompared with the model group，the hemorheology indexes were decreased significantly，the activated partial thromboplastin time(APTT)，prothrombin time(PT)and thrombin time(TT)were prolonged and plasma fibrinogen was reduced in the prepared Radix Rehmanniae groups with middle and high dosages.ConclusionThe aqueous extract of prepared Radix Rehmanniae improves hemorheology and coagulation in acute bloodstasis rats through reducing haematocrit(HCT)and erythrocyte sedimentation rate(ESR)，shortening the platelet aggregation time，prolonging thrombin time and reducing the content of fibrinogen.

Radix Rehmanniae Preparata；blood-stasis；hemorheology；blood coagulation function

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.014

1006-8783(2015)05-0621-04

2015-05-11

广东省中医药局基金(20151065，20141227)；广州市中医药和中西医结合科技项目(20152A011011，20142A011012)

刘若轩(1984—)，男，学士，主管药师，主要从事抗代谢综合征的天然药物开发，Email:lrx1221＠163.com；通信作者:郭洁文(1968—)，女，主任药师，博士生导师，主要从事天然药物开发，Email:guo774＠sina.com。

时间:2015-09-29 15:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150929.1538.002.html

Effect of the prepared Radix Rehmanniae on hemorheology and coagulation in acute blood-stasis rats