毛蕊花糖苷对高脂模型大鼠血脂及血管内皮细胞Bax-Bcl2表达的影响

邓志军，刘若轩，李常青，郭洁文，李丽明，齐耀群，李阿荣，王佳佳

(1.广州市中医医院药学部，广东广州510130；2.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405)

毛蕊花糖苷对高脂模型大鼠血脂及血管内皮细胞Bax-Bcl2表达的影响

邓志军1，刘若轩1，李常青2，郭洁文1，李丽明1，齐耀群1，李阿荣1，王佳佳1

(1.广州市中医医院药学部，广东广州510130；2.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405)

目的研究毛蕊花糖苷对高脂模型大鼠血管内皮细胞凋亡相关蛋白的表达作用。方法高脂饮食喂养建立高血脂模型，设模型组、辛伐他汀组(10 mg/kg)、毛蕊花糖苷低剂量组(50 mg/kg)、毛蕊花糖苷中剂量组(100 mg/kg)、毛蕊花糖苷高剂量组(200 mg/kg)和空白对照组，利用生化分析仪测定血脂、抗氧化指标，采用Western-blot法测定腹主动脉中细胞凋亡相关蛋白基因Bax与Bcl-2的表达。结果与模型组比较，毛蕊花糖苷高剂量组能显著降低模型大鼠血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与脂质过氧化产物(MDA)含量(P＜0.01)，总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显提高(P＜0.01或P＜0.05)。毛蕊花糖苷中、高剂量组Bax蛋白表达显著下调、Bcl-2蛋白表达明显上升(P＜0.01)。结论毛蕊花糖苷通过调节凋亡蛋白Bax-Bcl-2，对抗高脂模型大鼠所致的血管内皮细胞凋亡及高脂血症所致的氧化损伤。

毛蕊花糖苷；熟地黄；细胞凋亡；Bax；Bcl-2

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

熟地黄高纯度单体提取物，含毛蕊花糖苷大于98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号20130053；辛伐他汀片，默沙东制药有限公司，批号100548，用0.5%CMC-Na配成混悬剂；胆固醇，Sigma公司；丙二醇，广州化学试剂厂；脱氧胆酸钠，广州浩玛生物科技有限公司；蔗糖，广州化学试剂厂；血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，上海科华生物工程股份有限公司；总超氧化物歧化酶(TSOD)、脂质过氧化产物(MDA)，南京建成生物工程研究所；小鼠抗大鼠Bcl-2单抗(克隆系C-2)、小鼠抗大鼠Bax单抗(克隆系B-9)，美国Santa cruz公司；二抗为HRP标记的兔抗羊，武汉博士的生物科技有限公司；内参选用β-actin DAB显色，北京中杉生物技术公司。

1.2 高脂肪乳剂的制备

高纯度猪油400 g，加热至液化，加入胆固醇150 g、吐温-20 40 g，液化成油相；蒸馏水300 mL，加入全脂奶粉100 g、蔗糖150 g、丙二醇32 g，加热至60℃，加入脱氧胆酸钠15 g，混合均匀，制成水相，然后倒入油相中混匀，冷却后4℃储藏，使用时50℃左右化开。

1.3 实验仪器

KDC-220HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；SW-CJ-2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；202-0S台式干燥箱，苏州江东精密仪器有限公司；EL-160电子分析天平，日本岛津公司；ECHO全自动生化分析仪，意大利乐高特仪器公司；Lecia切片机，德国LECIA公司；HSWX-420BS电热恒温水(浴)箱，上海圣科仪器设备有限公司；BIO-RAD GC-800光密度扫描仪、凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；ZFMQ050PE超纯水器，美国Millipore公司。

1.4 实验动物

SPF级SD雄性大鼠80只，体质量180～200 g，广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2013-0002。

1.5 高血脂模型的建立及分组给药

80只SD雄性大鼠适应饲养1周后，按体质量随机分为空白对照组10只，高血脂模型组70只，模型组灌饲高脂肪乳剂1 mL/100 g，每日2次，空白对照组给予等容积溶媒。连续喂养5周后，末次给药后次日，眶后静脉丛取血，测定TC，以TC在5～10 mmol/L范围内判定造模成功。从造模成功的大鼠中随机抽取50只，分为模型组、辛伐他汀组，毛蕊花糖苷低剂量组(50 mg/kg)、毛蕊花糖苷中剂量组(100 mg/kg)、毛蕊花糖苷高剂量组(200 mg/kg)，各给药组大鼠均连续给药4周，空白对照组及模型组给予等容积溶媒。

1.6 血浆样品的采集、处理

各组大鼠均腹腔注射10%(φ)的水合氯醛麻醉，腹主动脉取血；在4 000 r/min，离心10 min，取离心的上清血清按试剂盒说明书操作，生化分析仪测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA及T-SOD含量，MDA和硫代巴比妥酸在95℃的条件下可以生成棕红色的3，5，5-三甲基恶唑-2，4二酮，其在532 nm处有最大吸收；T-SOD黄嘌呤氧化酶经反应产生的硝酸盐减少，在550 nm的波长上检测。

1.7 Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平

将剥取的主动脉约100 mg用冷PBS洗2次，放入研钵中，加入预冷细胞裂解液RIPA裂解细胞，研磨后吸出于1.5 mL EP管内，再加入500 μL RIPA，研磨后吸出于上EP管内，在冰面上裂解30 min，4℃、14 000 r/min离心10 min后，将上清分装于0.5 mL EP管内，每管100 μL，－20℃保存待用，用BCA法蛋白定量；常规蛋白电泳分离胶浓度为10% (pH8.8)，浓缩胶浓度5%(pH 6.8)，将纯化的蛋白行SDS-PAGE电转至PVDF膜；5%脱脂奶粉4℃封闭30 min，一抗孵育过夜小鼠抗大鼠Bax(1∶100)、Bcl-2(1∶150)、β-actin(1∶100)，TBST洗涤3次后，加入HRP标记的山羊抗大鼠的二抗室温摇床孵育45 min，TBST常规洗膜3次后，ECL化学发光试剂显色；用BIO-RAD GC-800光密度扫描仪对胶片进行扫描并保存，β-actin为内参对照，计算相对含量。BIO-RAD分析软件对蛋白含量进行灰度值分析，以各实验组中目的蛋白Bcl-2、Bax与相应的内参βactin的灰度的比值作为计算目的蛋白的相对含量。1.8 统计学分析

2 结果

2.1 毛蕊花糖苷对模型大鼠血脂的影响

如表1所示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C显著升高，HDL-C显著降低(P＜0.01)，提示造模成功。与模型组比较，毛蕊花糖苷高剂量组可显著降低模型大鼠血清TC、TG、LDL-C水平(P＜0.01)，提高HDL-C水平(P＜0.05)，毛蕊花糖苷中、低剂量组改善血脂的效果依次降低。

表1 毛蕊花糖苷对模型大鼠血脂的影响Table 1 Effects of verbascoside on the level of blood lipid in model rats(±s，n＝10)

表1 毛蕊花糖苷对模型大鼠血脂的影响Table 1 Effects of verbascoside on the level of blood lipid in model rats(±s，n＝10)

与空白对照组比较:＃＃P＜0.01；与模型组比较:∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

组别 剂量/ (mg·kg－1) c(TC)/ (mmol·L－1) c(TG)/ (mmol·L－1) c(HDL-C)/ (mmol·L－1) c(LDL-C)/ (mmol·L－1)空白对照组 － 2.56±0.57 1.85±0.43 2.28±0.39 1.97±0.39模型组 － 10.16±2.15＃＃9.84±2.27＃＃1.08±0.21＃＃2.99±0.31＃＃辛伐他汀组 10 6.12±1.27∗∗7.43±1.57∗2.03±0.47∗2.03±0.41∗毛蕊花糖苷低剂量组 50 8.99±1.78∗8.98±2.14 1.41±0.33 2.68±0.33中剂量组 100 7.87±0.45∗8.04±1.21 1.76±0.46∗2.44±0.54∗高剂量组 200 6.50±2.33∗∗7.48±1.32∗1.96±0.31∗∗2.11±0.33∗

2.2 毛蕊花糖苷对模型大鼠血清T-SOD、MDA的影响

如表2所示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清T-SOD显著降低(P＜0.01)、MDA升高(P＜0.05)，提示高血脂会影响抗氧化能力。与模型组比较，毛蕊花糖苷各剂量组均能不同程度改善抗氧化指标，其中毛蕊花糖苷高剂量组可显著升高T-SOD、降低MDA含量(P＜0.01)，抗氧化作用最强。

2.3 毛蕊花糖苷对模型大鼠主动脉Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠的Bax蛋白表达显著上调、Bcl-2蛋白表达显著下调(P＜0.01)。与模型组比较，毛蕊花糖苷提取物中、高剂量组的Bax蛋白表达均能显著下调、Bcl-2蛋白表达也能显著上调、Bcl-2/Bax比值显著升高(P＜0.01)。见图1、表3。

表2 毛蕊花糖苷对模型大鼠血清T-SOD、MDA的影响Table 2 Effects of verbascoside on serum T-SOD and MDA levels in model rats(±s，n＝10)

表2 毛蕊花糖苷对模型大鼠血清T-SOD、MDA的影响Table 2 Effects of verbascoside on serum T-SOD and MDA levels in model rats(±s，n＝10)

与空白对照组比较:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较: ∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

组别 剂量/ (mg·kg－1) T-SOD/ (U·mg－1) MDA/ (nmol·mg－1)空白对照组 － 329.33±35.78 9.64±1.97模型组 － 232.17±36.28＃＃13.72±3.64＃辛伐他汀组 10 286.65±33.79∗11.32±2.48∗毛蕊花糖苷低剂量组 50 237.25±44.78 12.75±2.59中剂量组 100 262.91±50.39∗11.37±2.79高剂量组 200 308.16±52.47∗∗9.44±2.09∗∗

图1 Western blot检测各组Bax、Bcl-2的蛋白表达Figure 1 Expression of Bax and Bcl-2 protein detected by western blot

表3 毛蕊花糖苷对模型大鼠主动脉Bax、Bcl-2蛋白表达影响Table 3 Effects of verbascoside on Bax and Bcl-2 expression in abdominal aorta in model rats(±s，n＝10)

表3 毛蕊花糖苷对模型大鼠主动脉Bax、Bcl-2蛋白表达影响Table 3 Effects of verbascoside on Bax and Bcl-2 expression in abdominal aorta in model rats(±s，n＝10)

与空白对照组比较:＃＃P＜0.01；与模型组比较:∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

组别 剂量/ (mg·kg－1) Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax空白对照组 － 0.22±0.03 0.99±0.24 4.31±0.71模型组 － 1.05±0.31＃＃0.25±0.03＃＃0.22±0.04＃＃辛伐他汀组 10 0.49±0.14∗∗0.46±0.14∗0.97±0.36∗毛蕊花糖苷低剂量组 50 0.89±0.26 0.37±0.13∗0.45±0.09∗中剂量组 100 0.65±0.15∗∗0.63±0.20∗∗0.93±0.31∗∗高剂量组 200 0.38±0.09∗∗0.80±0.23∗∗2.35±0.53∗∗

3 讨论

毛蕊花糖苷是熟地黄中的主要有效成分，研究已证实其具有神经保护、降血糖、抗衰老、免疫调节等作用[2]。本研究通过建立高脂血症模型大鼠，研究毛蕊花糖苷对血管内皮细胞凋亡相关蛋白表达作用。

高脂血症通过激活血管平滑肌细胞 Wnt/βcatenin信号通路，平滑肌细胞增殖增加、表型改变，损伤内皮细胞，促进细胞呼吸链上活性氧产生，激活细胞内氧化应激损伤，破坏细胞膜的骨架和细胞质结构与功能，诱导内皮细胞凋亡或坏死[3-4]。高脂血症使血管内皮细胞自由基释放增加，直接损伤动脉壁的抗氧化功能[5-6]。因此提高机体抗氧化防御能力、有效清除自由基，可抵抗脂质过氧化物生成，并抵御自由基和脂质过氧化物损伤机体。

Bax与Bcl-2两种基因是调控细胞凋亡的关键因素，Bax同源二聚体的形成调控着细胞对凋亡的易感性，Bax处于优势则细胞死亡，Bcl-2作用相反，两者的比值决定着细胞凋亡抑制作用的强弱；抗凋亡机制又与抗氧化作用密切相关[7]。本研究结果显示高脂血症大鼠的主动脉Bax蛋白表达显著增高，Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值显著减低，证实高脂血症可诱导血管内皮细胞凋亡；给予毛蕊花糖苷后其Bax蛋白表达增高、Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值减低，提示毛蕊花糖苷与Bcl-2基因具有协同效应，共同对抗高脂血症所致的氧化损伤，这也与既往发现熟地黄可抑制脂质过氧化产物MDA含量、具有抗氧化作用的文献报道一致[8]。

本实验利用生化分析仪测定血脂、抗氧化指标，并采用Western blot法测定毛蕊花糖苷对高脂模型大鼠腹主动脉中细胞凋亡相关蛋白基因Bax与Bcl-2表达，为阐明脉复生的药效物质基础及作用机制提供了理论与实验依据，但Bcl-2蛋白表达是通过哪种基因通路调节血脂尚需进一步研究。

[1]邓敏，鞠晓东，樊东升，等.毛蕊花苷对 MPP＋诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用[J].中国药理学通报，2008，24(10):1297-1302.

[2]杨云，张华锋，刘炯，等.道地产区不同品种怀地黄中梓醇及毛蕊花糖苷的含量比较[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(16):97-101.

[3]RODRIGUEZ C，SLEVIN M，RODRIGUEZ-CALVO R，et al. Modulation of endothelium and endothelial progenitor cell function by low-density lipoproteins: implication for vascular repair，angiogenesisand vasculogenesis[J]. Pathobiology，2009，76(1):11-22.

[4]庄瑜，肖明第，吕志前，等.Wnt/beta-catenin信号通路在高脂血症中的激活[J].现代生物医学进展，2012，12 (9):1624-1627.

[5]霍阳，初巍巍，宋涛，等.维生素E对高脂血症小鼠血管内皮细胞凋亡相关蛋白基因表达的影响[J].解放军医药杂志，2013，25(12):62-65.

[6]段宗强.木犀草素对高脂血症大鼠血脂、血糖及氧化应激指标的影响[J].中医学报，2014，29(1):55-57.

[7]KAUNTZ H，BOUSSEROUEL S，GOSSE F，et al.Silibinin，a naturalflavonoid，modulates the early expression of chemoprevention biomarkers in a preclinical model of colon carcinogenesis[J].Int J Oncol，2012，41(3):849-854.

[8]麻锐，丁瑞恒，廖蕴华.不同浓度地黄对大鼠肾组织抗氧化作用的研究[J].内科，2012，7(3):220-223.

(责任编辑:幸建华)

Effects of verbascoside on the expression of lipid and Bax-Bcl2 in vascular endothelial cells in rats with hyperlipidemia

DENG Zhijun1，LIU Ruoxuan1，LI Changqing2，GUO Jiewen1，LI Liming1，QI Yaoqun1，LI Arong1，WANG Jiajia1
(1.Department of Pharmacy，Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130，China；2.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China)

ObjectiveTo study the effects of verbascoside on the expression of apoptosis-related proteins in vascular endothelial cells in rats with hyperlipidemia.MethodsThe rat models with hyperlipidemia were established by feeding high-lipid diets and then were randomly divided into the model group，the simvastatin group(10 mg/kg)，three verbascoside groups with low，middle and high dosages(50，100 and 200 mg/ kg)，and the control group.The blood lipids and antioxidant index were determined by biochemical analyzer.The expression of apoptosis-related protein Bax and Bcl-2 in abdominal aorta was determined by western blot.ResultsCompared to the model group，the high dosage verbascoside group significantly reduced the levels of serum total cholesterol(TC)，glycerol lipid(TG)，low density lipoprotein cholesterol (LDL-C)and lipin peroxide(MDA)(P＜0.01)，and increased the levels of total superoxide dismutase(T-SOD)and high density lipoprotein cholesterol(HDL-C)(P＜0.05 or P＜0.01).The expression of Bax in middle and high dosage groups was significantly decreased，but Bcl-2 expression was increased(P＜0.01).ConclusionVerbascoside can reduce the apoptosis of vascular endothelial cells and oxidative damage in rats with hyperlipidemia through regulation of Bax and Bcl-2 expression.

verbascoside；Radix Rehmanniae；apoptosis；Bax；Bcl-2“脉复生”是我院研制并用于治疗血栓闭塞性脉管炎的特色中药制剂，熟地黄是君药，由玄参科植物地黄加工炮制而成。现代药理研究[1]证实其活性成分毛蕊花糖苷可通过线粒体膜电位的高能状态抑制caspase-3活性对抗MPP＋诱导的SHSY5Y细胞凋亡。本实验研究了毛蕊花糖苷对高脂模型大鼠血管内皮细胞凋亡的保护作用，为阐明脉复生的药效物质基础及作用机制提供理论与实验依据。

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.015

1006-8783(2015)05-0625-04

2015-06-07

广东省中医药局基金项目(20141227，20151065)；广州市中医药和中西医结合科技项目(20152A011011，

20142A011012)

邓志军(1980—)，男，硕士，主管药师，主要从事抗代谢综合征的天然药物开发，Email:86878226＠qq.com；通信作者:郭洁文(1968—)，女，主任药师，博士生导师，主要从事天然药物开发，Email:guo774＠sina.com。

时间:2015-09-24 16:11

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1611.008.html