地黄丸类方对肾阳虚大鼠免疫功能的影响

吴依娜，尹西拳，孔秀娟，张蓓，邱晶晶，赖小平，李耿

地黄丸类方对肾阳虚大鼠免疫功能的影响

吴依娜，尹西拳，孔秀娟，张蓓，邱晶晶，赖小平，李耿

(广州中医药大学中药学院，广东广州510006)

目的观察3种地黄丸类方对肾阳虚大鼠免疫功能的影响，并从基因水平探讨其免疫调节的机制。方法采用氢化可的松注射液肌注2周造成肾阳虚大鼠模型，造模成功后，六味、桂附、知柏地黄丸连续灌胃给药3周，应用酶联免疫法(ELISA)检测各组大鼠血清IL-2及IL-4的含量，荧光定量PCR法检测各组大鼠肾组织NF-κB mRNA表达水平。结果与正常组比较，模型组胸腺质量显著下降，血清IL-2、IL-4水平显著改变(P＜0.05)；与模型组比较，桂附地黄丸、六味地黄丸均可显著提高胸腺质量，改善血清IL-2、IL-4水平(P＜0.05)，知柏地黄丸无显著改变作用(P＞0.05)；与模型组比较，六味、桂附地黄丸各组均可显著降低大鼠肾组织NF-κB mRNA表达量(P＜0.05)，知柏地黄丸无显著改变作用(P＞0.05)。结论六味地黄丸、桂附地黄丸对于肾阳虚大鼠免疫功能有一定的改善作用，知柏地黄丸改善作用不显著。

氢化可的松；地黄丸类方；免疫；NF-κB通路

肾阳虚证为中医的基本证型之一，临床主要表现为面色晄白、形寒肢冷、精神不振、腰膝酸冷、阳痿阴缩、遗精尿频、小便清长、余沥不净、夜尿频多，女子带下清稀、宫寒不孕，或尿少心悸、肢肿气短、喘咳痰饮等，舌淡苔白润，脉虚弱无力[1]。研究发现肾虚证与T淋巴细胞的变化密切相关，而人体的T淋巴细胞来源于骨髓干细胞，在胸腺中分化成熟，是免疫系统的主要效应细胞，也是最重要的免疫细胞，主要介导细胞免疫[2]。目前肾虚本质的研究主要集中在神经内分泌系统、免疫系统、自由基、衰老等方面[3-4]。本研究采用经典肾阳虚造模方法用氢化可的松注射液肌注2周造成肾阳虚大鼠模型，通过应用酶联免疫法(ELISA)检测各组大鼠血清IL-2及IL-4的含量；应用荧光定量PCR法检测各组大鼠肾组织NF-κB mRNA表达水平，评价地黄丸类方对肾阳虚大鼠免疫功能的影响。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2008-0020。

1.2 药物与试剂

六味地黄丸(河南省宛西制药股份有限公司，批号:120309)；知柏地黄丸(河南省宛西制药股份有限公司，批号:120301)；桂附地黄丸(河南省宛西制药股份有限公司，批号:120402)；氢化可的松注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批号:1110211)；无菌生理盐水(贵州科伦药业有限公司，批号: 20130621)；RNAiso Plus(TaKaRa BIO INC，Cat.No.＃9108/9109)；PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa BIO INC，Cat.＃RR047A)；氯仿(＞99.8%)、EDTA-2Na· 2H2O、焦碳酸二乙酯(美国Sigma公司)；Tris(The Dow Chemical Company)；无水乙醇、异丙醇(广州化学试剂厂)；引物(Invitrogen公司)。

1.3 实验仪器

LF26-MESJ分析天平(香港佳立国际有限公司)；TC-3K电子天平(深圳市华恒科技有限公司)；MC-246欧姆龙体温计[欧姆龙(大连)有限公司]；RT-2100C酶标仪(深圳雷杜公司)；FastPrep-24匀浆机(MP公司)；LX-100手掌型离心机(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；GL-3250A磁力搅拌器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；SKG-01电热恒温干燥箱(湖北省黄石市医疗器械厂)；TGL-16G-A冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；核酸蛋白检测仪(美国Bio-Rad)。

2 方法

2.1 分组与造模

取SD大鼠80只，体质量180～220 g，雄性，随机分为正常组10只，氢化可的松组70只。除正常组肌肉注射等体积生理盐水外，其余大鼠每天于后肢外侧肌肉注射氢化可的松注射液2.5 mg/100 g，左右后肢交替注射，连续注射14 d。造模结束后，即第15天开始，除正常组外，其余大鼠按照体质量及肛温随机分为模型组、六味地黄丸低(43.2 mg/mL)、高剂量组(172.8 mg/mL)，桂附地黄丸低(40.8 mg/mL)、高剂量组(163.2 mg/mL)，知柏地黄丸低(40.8 mg/mL)、高剂量组(163.2 mg/mL)，每组10只。六味、桂附、知柏地黄丸高、低剂量组分别为灌胃0.9 g/kg和3.6 g/kg(生药量/体质量)混悬液，灌胃体积为10 mL/kg，正常组、模型组给予等体积灭菌蒸馏水，连续21 d。末次给药后1 h，10%(φ)水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血5～6 mL，平均分装于无肝素钠离心管和有肝素钠离心管中，静止1～2 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清、血浆，冻存于－80℃超低温冰箱中。

2.2 血清IL-2、IL-4水平检测

取各组大鼠血清样品，按照试剂盒说明书检测各组大鼠血清白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4 (IL-4)。

2.3 大鼠肾组织NF-κB mRNA表达水平检测

分别配制 0.5 mol/L，pH8.0的 EDTA溶液、0.1%DEPC水、10×TE Buffer(pH8.0)，将储存于冷冻柜的各组肾脏组织取出，不可以先行解冻，以避免RNase的作用，提取总RNA，并用核酸蛋白检测仪测定其浓度和A260/A280比值考察RNA纯度，在逆转录作用后，用荧光实时定量RT-PCR反应。ΔCt值是NF-κB与内参的差值，NF-κB mRNA表达量采用相对定量法计算(2－ΔΔCt)，以正常组为对照组，计算各组相对表达量。

2.4 统计学处理

使用SPSS 17.0 for windows统计软件，采用单因素方差分析(ANOVA)法，实验结果以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 地黄丸类方对胸腺质量、血清IL-2、血清IL-4的影响

与正常组比较，模型组胸腺质量显著降低，胸腺明显萎缩(P＜0.01)，血清IL-2含量显著降低(P＜ 0.01)，血清IL-4含量显著升高(P＜0.01)，提示造模成功。与模型组比较，六味地黄丸高、低剂量组和桂附地黄丸高、低剂量组均可显著提高大鼠胸腺质量，升高血清IL-2含量，降低血清IL-4含量，提示六味地黄丸和桂附地黄丸可显著改善肾阳虚大鼠的免疫功能，且桂附地黄丸效果更加显著，可使其水平恢复至正常值。见表1。

表1 3种地黄丸类方对大鼠胸腺质量及血清细胞因子水平的影响Table 1 Effects of three kinds of Dihuangwan class parties on the thymus weight and cytokine levels in rats(±s，n＝10)

表1 3种地黄丸类方对大鼠胸腺质量及血清细胞因子水平的影响Table 1 Effects of three kinds of Dihuangwan class parties on the thymus weight and cytokine levels in rats(±s，n＝10)

与正常组比较:∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较:＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别 剂量/(g·kg－1) m(胸腺)/g ρ(IL-2)/(ng·L－1) ρ(IL-4)/(ng·L－1)正常组 - 0.39±0.04 1028.75±307.54 77.68±5.52模型组 - 0.19±0.03∗∗731.25±78.49∗∗100.09±9.79∗∗六味地黄丸 高剂量组 1.728 0.32±0.06∗＃＃876.88±50.3∗＃91.21±7.33∗∗＃＃低剂量组 0.432 0.32±0.05∗＃＃862.71±53.49∗∗＃91.07±5.24∗∗＃＃桂附地黄丸 高剂量组 1.632 0.38±0.07＃＃1001.67±142.39＃＃79.55±7.45＃＃低剂量组 0.408 0.36±0.08＃＃915.00±116.91＃＃81.85±8.83＃＃知柏地黄丸 高剂量组 1.632 0.22±0.06∗∗846.88±59.1∗∗93.87±6.39∗∗低剂量组 0.408 0.21±0.05∗∗816.88±40.16∗∗95.12±4.24∗∗

3.2 地黄丸类方对大鼠肾组织NF-κB mRNA表达的影响

核酸蛋白检测仪测定各管总RNA的A260/A280比值均在2.0左右，说明提取的总RNA质量和纯度符合要求。荧光定量PCR扩增结果如图1、2所示，目的基因与内参基因扩增曲线均光滑平稳，荧光吸收图谱的S形曲线形状完好，符合定量检测要求；完成扩增后，目的基因和内参基因扩增产物均可形成良好的熔解曲线峰形，表明不存在引物二聚体或非特异性产物等的干扰。

各组目的基因相对表达量如表2所示，与模型组比较，六味地黄丸高、低剂量组、桂附地黄丸高、低剂量组差异均有统计学意义P＜0.05)，知柏地黄丸高、低剂量组差异无统计学意义(P＞0.05)；与桂附地黄丸组比较，知柏地黄丸高、低剂量组差异有统计学意义(P＜0.05)；其余各组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。表明六味地黄丸、桂附地黄丸可能通过调节NF-κB信号转导通路，使肾阳虚大鼠血清细胞因子水平恢复正常，从而达到调节免疫的作用。

表2 3种地黄丸类方对大鼠NF-κB mRNA表达的影响Table 2 Effect of three kinds of Dihuangwan class parties on the expression of NF-κB mRNA in rats(±s，n＝3)

表2 3种地黄丸类方对大鼠NF-κB mRNA表达的影响Table 2 Effect of three kinds of Dihuangwan class parties on the expression of NF-κB mRNA in rats(±s，n＝3)

与模型组比较:＃＃P＜0.01。

组别 剂量/ (g·kg－1) NF-κB mRNA表达量正常组 － 1模型组 － 1.08±0.14六味地黄丸 高剂量组 1.728 0.60±0.19＃＃低剂量组 0.432 0.62±0.28＃＃桂附地黄丸 高剂量组 1.632 0.40±0.16＃＃低剂量组 0.408 0.48±0.03＃＃知柏地黄丸 高剂量组 1.632 0.82±0.09低剂量组 0.408 0.85±0.13

图1 内参GAPDH扩增曲线Figure 1 Amplification curve of internal reference GAPDH

图2 NF-κB扩增曲线Figure 2 Amplification curve of NF-κB

3 讨论

地黄丸类复方最早出现在东汉张仲景的《金匮要略》中，即是后世用来温补肾阳的“金匮肾气丸”，又叫肾气丸、八味肾气丸、桂附地黄丸。六味地黄丸是在肾气丸的基础上减去刚燥的附子、桂枝，改干地黄为熟地黄，组成的滋补肾阴的经典名方。而知柏地黄丸则是在六味地黄丸的基础上添加了知母和黄柏两味药，常用于治疗肾阴虚证。

Th细胞是T细胞的其中一个亚群，通常分为Th1和Th2两种。Th1主要分泌IL-2，与细胞免疫有关；而Th2主要分泌IL-4，与体液免疫有关。当机体处于正常状态时，Th1和Th2处于动态平衡，调节细胞免疫和体液免疫功能。当机体受到异己成分攻击时，Th1和Th2细胞中某一亚群功能升高，另一亚群功能降低，出现Th1/Th2漂移现象[5]。

NF-κB是存在于细胞质中一种重要的核转录因子，处于TLR下游信号通路的枢纽位置。当细胞静止时，NF-κB与其抑制单位IκB的中心区结合，形成NF-κB＋IκB复合体。细胞活化后，复合体解离进入细胞核，与特定的DNA序列结合，调节炎性细胞因子等基因转录，影响Th1促炎细胞因子和Th2抗炎细胞因子，分别介导细胞免疫和体液免疫[6]。本实验通过给予肾阳虚大鼠模型六味地黄丸、桂附地黄丸、知柏地黄丸3种地黄丸类方，结果发现桂附地黄丸、六味地黄丸均可显著改变血清IL-2、IL-4水平，知柏地黄丸无显著性改变作用。模型组大鼠肾组织NF-κB mRNA表达量显著升高，NF-κB异常活化，六味、桂附地黄丸均可不同程度降低大鼠肾组织NF-κB mRNA表达量，其中桂附地黄丸效果最优，其与知柏地黄丸存在显著性差异。

肾阳虚证是中医临床上重要的症候之一，多年来对肾阳虚证的研究颇多，其与免疫的关系也是备受关注的研究热点，本研究对几种地黄丸类方在肾阳虚大鼠免疫调节作用进行比较，结合本实验结果可以发现，六味地黄丸和桂附地黄丸在免疫功能改善方面表现出一定的相似性，推测地黄丸类方免疫调节的物质基础可能是复方的“三补”部分。课题前期对“三补”部分的物质基础进行研究，发现熟地黄、山药、山茱萸均以多糖为其主要活性成分，大量文献表明熟地、山药、山茱萸中主要活性成分多糖的药理作用主要集中在调节免疫方面[7-9]，这也佐证了对于“三补”部分重在调节免疫的分析。而知柏地黄丸则未表现出明显的调节免疫作用，分析可能与该复方药性偏寒有关，其对肾阳虚大鼠出现的便溏等虚寒症状未有作用，再加上其“三补”组分含量降低导致未能表现出免疫调节作用。

[1]于赫，郭丽新.肾阳虚证的生物化学与分子生物学研究进展[J].中医药信息，2005，22(6):41-44.

[2]林礼兴，林丽婷，雷焕英，等.衰老与肾虚症及T细胞亚群间关系初探[J].福建中医药，2000，22(1):192.

[3]张云飞，文秀华，罗茂林.肾虚本质的现代研究进展[J].现代中西医结合杂志，2004，13(8):1101-1103.

[4]沈皓，蔡德培，陈伯英.补肾中药对下丘脑-垂体促性腺机能的影响[J].中西医结合学报，2004，2(1):53-57

[5]李庆阳，郑家铿.老年肾虚与T细胞亚群关系[J].福建中医学院学报，2001，11(2):5-6.

[6]SCHMITZ M L，BACHER S，KRACHT M.Iκb independent control of NF-κb activity by modulatory phosphorylations [J].Trends Biochem Sci，2001，26(3):186-190.

[7]李发胜，徐恒瑰，李明阳，等.熟地多糖提取物对小鼠免疫活性影响[J].中国公共卫生，2008，24(9):1109-1110.

[8]许效群，刘志芳，霍乃蕊，等.山药多糖的体外抗氧化活性及对正常小鼠的免疫增强作用[J].中国粮油学报，2012，27(7):42-46、51.

[9]苗明三，方晓燕，杨云.山茱萸多糖对小鼠免疫功能的影响[J].河南中医，2002，22(2):12-13.

(责任编辑:幸建华)

Effects of Dihuang wan compound on the immunologic function in kidney deficiency rats

WU Yina，YIN Xiquan，KONG Xiujuan，ZHANG Bei，QIU Jingjing，LAI Xiaoping，LI Geng
(School of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo study the effects and potential mechanisms of three kinds of Dihuangwan class parties on the immunologic function in kidney deficiency rats.MethodsThe classic model was established by intramuscular injection of hydrocortisone two weeks.Liuweidihuangwan，Guifudihuangwan and Zhidihuangwan were intragastrically administrated for three weeks.Serum IL-2 and IL-4 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The expression of NF-κB mRNA in kidney tissue was detected by quantitative PCR.ResultsCompared with the normal group，the thymus weight was decreased，and IL-2 and IL-4 levels were changed in the model group.Treatment with Guifudihuangwan and Liuweidihuangwan，but not Zhibaidihuangwan，significantly restored the thymus weight and altered serum IL-2 and IL-4 levels in rats.Compared with the model group，treatment with Guifudihuangwan and Liuweidihuangwan obviously reduced NF-κB mRNA expression in kidney tissues.ConclusionGuifudihuangwan and Liuweidihuangwan may improve the immunological function in kidney deficiency rats.

hydrocortisone；Dihuangwan class party；immunity；NF-κB pathway

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.016

1006-8783(2015)05-0629-04

2015-05-27

国家自然科学基金项目(U30973945)；广州中医药大学创新课题(11CX023)

吴依娜(1965—)，女，教授，硕士研究生导师，主要从事中药的配伍与临床应用研究，Email:zywyn＠163.com；通信作者:李耿(1983—)，男，副教授，主要从事中药药效物质基础研究，Email:lg＠gzhtcm.edu.cn。

时间:2015-09-24 16:01

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1601.004.html