罗仙子提取物对H2O2损伤平滑肌细胞的保护作用

胡文龙，褚夫江，郑晓燕，郑少婷，卢雪梅，金小宝，朱家勇(广东药学院基础学院/药用生物活性物质研究所/广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006)

罗仙子提取物对H2O2损伤平滑肌细胞的保护作用

胡文龙，褚夫江，郑晓燕，郑少婷，卢雪梅，金小宝，朱家勇
(广东药学院基础学院/药用生物活性物质研究所/广东省生物活性药物研究重点实验室，广东广州510006)

目的观察罗仙子低分子量多肽提取物对SD大鼠大动脉平滑肌细胞氧化应激状态下的保护作用。方法原代培养SD大鼠大动脉平滑肌细胞，传代鉴定后分为对照组、模型组、罗仙子低分子量多肽提取物3个剂量组。H2O2诱导大动脉平滑肌细胞损伤模型，采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活数量，流式细胞术检测细胞凋亡情况，比色法测细胞培养液中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、H2O2酶的活性及丙二醛含量。结果建立H2O2损伤模型的半数抑制浓度为480 μmol/mL。罗仙子低分子量多肽提取物各浓度干预组的细胞活力均明显高于H2O2损伤模型组(P＜0.05)，并能显著降低氧化应激损伤的大动脉平滑肌细胞所释放的丙二醛，提高谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和H2O2酶的活性。结论罗仙子低分子量多肽提取物具有减轻H2O2损伤细胞的作用。

罗仙子低分子量多肽提取物；大动脉平滑肌细胞；氧化应激

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病发生的最直接原因之一[1]，其确切发病机制还未被完全阐明，氧化应激损伤是其中的一个重要机制。在血管的增龄性变化过程中，动脉中层的平滑肌细胞在氧化应激环境下的病理性增殖、凋亡和氧化应激信号分子的激活，是AS发生的重要环节，因此抗炎、抗氧化和抑制平滑肌细胞增殖是实现抗AS的重要途径。罗仙子原名蛆，又称五谷虫、谷虫，为我国传统天然药材之一。现已有不少研究证实罗仙子具有抗病毒[2]、抗肿瘤[3-5]、抗菌抗炎[6-7]、抗氧化[8-9]等功效。课题组前期研究发现罗仙子低分子量多肽提取物可降低AS小鼠与大鼠的血脂及炎症因子水平，有效抑制AS的发生与发展[6，10]。在进一步的研究中，筛选获得了罗仙子低分子量多肽提取物(相对分子质量＜30 000)，并对其在AS小鼠体内抗AS的作用进行了验证，结果显示该低分子量多肽提取物能有效改善动脉的粥样化病变，有效降低动物血清中IL-1α及TNF-α的水平。同时，还发现经罗仙子低分子量多肽提取物处理后动物的动脉血管内膜完整性良好，血管内膜下浸润的巨噬细胞数量减少[7]。基于此，本实验以氧化应激损伤状态下的SD大鼠血管平滑肌细胞作为模型，用罗仙子低分子量多肽提取物干预氧化应激损伤状态下的大鼠血管平滑肌细胞，探讨其对氧化应激损伤的大鼠平滑肌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

SD大鼠大动脉平滑肌细胞，原代培养，传代后本实验室保存；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清、PI(MP公司)；Ⅱ型胶原蛋白酶(Worthington公司)；兔抗 α-SM抗体(Abcam公司)；MTT、Ⅳ型弹性蛋白酶(Sigma公司)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、H2O2酶(CAT)及丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；羊抗兔二抗、DAPI(碧云天生物技术研究所)；AnnexinⅤ(Biolegend公司)；其他试剂为分析纯。

1.2 SD大鼠大动脉平滑肌细胞的原代与传代培养

参照文献[11]，取4～6周龄雄性SD大鼠大动脉，剥净血管外脂肪和结缔组织，纵向切开血管，刮除内皮后剪碎，用胶原蛋白酶和弹性蛋白酶消化获取大动脉平滑肌细胞。此后隔天更换培养液，直至形成单层细胞，用含0.25%胰酶消化，进行传代培

养，鉴定后取5～10代细胞用于实验。

1.3 免疫荧光和流式细胞术检测平滑肌细胞α-SM表达情况

将洁净的圆形小玻片置于细胞培养孔中，细胞浓度调至每片5×104个，次日取出板孔中细胞爬片，4%(φ)多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤2～3次；滴加封闭液覆盖爬片，室温静置60 min；加入稀释度为1∶200的兔抗α-SM抗体，37℃孵育90 min，PBS洗涤同上；滴加稀释度为1∶200的羊抗兔IgG-FITC，洗涤完毕后在荧光显微镜下观察拍照。

1.4 MTT法测定细胞活性

取生长状态良好细胞，调整细胞密度为8×104个/mL，按0.1 mL含细胞的培养液接种于96孔板培养24 h，随机分为对照组、H2O2模型组、罗仙子低分子量多肽提取物组(0、5、20、80 μg/mL)。培养12 h后弃除培养基，各孔都加入筛选获得H2O2(IC50)；12 h后更换为100 μL/孔MTT，4 h后再次更换为100 μL/孔DMSO，待紫色结晶充分溶解后用酶标仪测490 nm处的吸收值(A值)。实验设3个平行孔同时设定阴性对照和空白对照组，结果重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况

将细胞按2×105个/孔接种6孔板，24 h后分组和给药情况参照“1.4”；实验完毕后分别收集上清液和细胞，加入1 mL结合缓冲液重悬细胞，离心后沉淀重悬在 100 μL的结合缓冲液中，加入 2 μL AnnexinⅤ，避光反应15 min后加入2 μL PI，继续反应5 min，流式细胞仪检测其凋亡情况。

1.6 检测指标

收集“1.5”实验处理后细胞上清液，按GSH-Px、MAO、SOD、CAT及MDA试剂盒说明书要求测定各指标含量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 SD大鼠大动脉平滑肌细胞原代与传代培养情况

培养24 h后，细胞贴壁呈长梭形，胞核呈杆状或椭圆状，可见2个或2个以上的核仁；72 h后，细胞呈束状排列；2周后，各细胞群融合，呈波峰和波谷样形态；传代后细胞形态稳定。见图1。

图1 RASMC原代与传代培养Figure 1 Primary culture and subculture of rat aortic smooth muscle cells

2.2 免疫荧光法和流式细胞术检测平滑肌细胞α-SM表达情况

荧光显微镜下可见，胞质部分均着色且分布均匀，证实该细胞为血管平滑肌细胞。见图2。

图2 免疫荧光观察大鼠血管平滑肌细胞α-SM的表达情况Figure 2 Expression of α-SM in rat aortic smooth muscle cells (200×)

2.3 MTT法测定细胞活性

不同浓度的H2O2对细胞的效应存在较大差异:当H2O2的浓度低于240 μmol/mL时，H2O2模型组的A值高于对照组；当其浓度高于240 μmol/ mL时，细胞存活率开始下降，并呈现剂量依赖性；当

H2O2浓度为480 μmol/mL时其A值降低到阴性对照组的一半，本实验以此浓度作为H2O2氧化应激剂量进行建模，剩余约50%细胞存活。与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图3A。不同浓度的罗仙子低分子量多肽提取物干预后均可抑制H2O2从而引起 A值降低，并呈剂量依赖性，与H2O2模型组相比，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图3B。

图3 MTT法测定细胞存活率Figure 3 Survival rate of rat aortic smooth muscle cells by MTT

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况

模型组的细胞凋亡率(35.77%)显著高于对照组(4.70%，P＜0.01)。不同浓度罗仙子低分子量多肽提取物(5、20、80 μg/mL)预处理后，细胞凋亡率显著下降(22.84%、18.21%、8.85%，P＜0.01)，见图4。

2.5 过氧化物酶含量

与对照组比较，模型组的MDA含量明显升高(P＜0.01)，SOD、CAT和GSH-Px的活性明显降低(P＜0.01)；罗仙子低分子量多肽提取物干预后能够显著提高SOD、CAT和GSH-Px活性(P＜0.05或P＜0.01)，降低MDA含量(P＜0.01)，见表1。

图4 流式细胞术检测细胞凋亡Figure 4 Apoptosis of rat aortic smooth muscle cells

表1 罗仙子低分子量多肽提取物对模型大鼠血管平滑肌细胞MDA、SOD、CAT和GSH-Px活性的影响Table 1 Expression of MDA，SOD，CAT and GSH-Px in rat aorta smooth muscle cells treated with LMPHE(±s，n＝3)

表1 罗仙子低分子量多肽提取物对模型大鼠血管平滑肌细胞MDA、SOD、CAT和GSH-Px活性的影响Table 1 Expression of MDA，SOD，CAT and GSH-Px in rat aorta smooth muscle cells treated with LMPHE(±s，n＝3)

与对照组比较:＃＃P＜0.01；与模型组比较:∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

组别 剂量/ (μg·mL－1) MDA/ (nmol·mg－1) ρ(SOD)/ (U·mL－1) ρ(CAT)/ (U·mL－1) ρ(GSH-Px)/ (U·mL－1)对照组 － 1.08±0.02 9.07±0.23 1.26±0.09 76.67±2.09模型组 － 2.33±0.05＃＃5.59±0.21＃＃0.73±0.01＃＃52.18±1.05＃＃罗仙子 低剂量 5 2.07±0.03∗∗6.74±0.02∗0.75±0.02 53.99±1.15中剂量 20 1.71±0.01∗∗7.33±0.15∗∗0.84±0.01∗∗55.09±1.20高剂量 80 1.29±0.04∗∗8.50±0.20∗∗0.95±0.03∗∗62.50±0.73∗∗

3 讨论

在血管细胞中最重要的活性氧(ROS)是由单价还原氧生成的超氧阴离子自由基(O2－)，O2

－对血管本身无毒性作用，但在SOD的作用下，可使O2－转化为H2O2，H2O2能与还原性过渡金属反应生成高活性的羟自由基(OH－)，其能被髓过氧化物酶(MPO)代谢生成次氯酸(HOCl)等更为不稳定的ROS，进一步放大血管及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)等应激损伤效应，特别是在斑块的形成、破裂与血栓形成中尤为重要[12]。在各种不同形式的ROS中，H2O2的性质较为稳定，可被应激状态下细胞产生的CAT 或GSH-Px还原为H2O，从而达到阻断ROS进一步氧化损伤的目的，因此SOD和CAT的活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，MDA和GSHPx含量的高低又常作为细胞受自由基攻击的严重程度的间接指标；而H2O2的作用类似于ox-LDL，能够很好模拟体机体氧化应激的演化进程[13-14]。基于此，本研究通过不同浓度H2O2损伤大鼠大动脉平滑肌细胞，结果显示，不同浓度的H2O2对细胞的效应存在较大差异，当H2O2的浓度低于240 μmol/ mL时，H2O2组的A值高于对照组，提示可能是较低浓度H2O2促进细胞增殖；当H2O2浓度高于240 μmol/mL时，细胞存活率开始下降，并随着H2O2浓度增加而降低，呈现剂量依赖性。这可能由于氧化应激强度超出细胞耐受范围，开始出现细胞凋亡。经筛选后获得建立氧化应激模型的最佳H2O2浓度为480 μmol/mL，在此浓度作用下可引起50%左右的细胞凋亡。

动脉粥样硬化主要表现为血管病变。在正常生理情况下，血管平滑肌细胞处于动脉中层，处于静止期，主要发挥收缩功能。在氧化应激等病理情况下，机体内ROS增加，诱导血管平滑肌细胞重新进入细胞周期，增殖并移行至内膜，吞噬ox-LDL后形成粥样斑块。随着病程进一步发展，大量蓄积的ROS会引起细胞凋亡，导致斑块破裂及血栓形成[12]，并且由其引起的细胞凋亡效应要远大于其所引起的细胞增殖现象[15]，因而抵抗氧化应激引起的细胞凋亡和抑制平滑肌细胞增殖是实现抗AS的重要途径。目前已有不少研究证实罗仙子存在抗氧化功效，刘彬等[8]基于化学反应法采用脱氧核糖-铁体系和邻苯三酚自氧化体系分别测定了不同浓度的罗仙子提取物对OH－和O2－的清除率，同时采用H2O2氧化体系测定了提取物的抗氧化值，结果显示罗仙子提取物对OH－和O2－的IC50分别为1.93 mg/mL和3.26 mg/mL，浓度为0.5%的提取物的抗氧化值为9.01 mg/g，相当于同浓度维生素C抗氧化值的1.29倍。同时测定了该提取物主要成分为富含小分子生物活性肽、氨基酸及糖类且具有耐热性质，提示这些物质的存在均有可能加快氧自由基的清除速度，起到抗氧化的作用。在体外实验中，Zhu等[9]将中性蛋白酶水解获得的罗仙子小分子多肽提取物干预处理HepG2细胞，发现该小分子多肽成分通过有效减少胞内ROS的含量和提高抗氧化酶活性进而发挥体外抵抗H2O2应激损伤的作用。本课题组前期研究发现，罗仙子粗提物干预高脂血症小鼠后可明显逆转肝脏的脂肪性病变，同时提高肝脏匀浆液中SOD活力，降低MDA的水平，具有一定的抗氧化和降血脂功能[10]。进一步采用葡聚糖凝胶过滤色谱分离纯化后获得该粗提物中的小分子量多肽混合物，其相对分子质量＜30 000，并在AS小鼠体内证实该小分子量多肽提取物为降血脂和抗AS的主要成分[7]。本实验借助H2O2诱导平滑肌细胞建立氧化应激模型为研究对象，干预不同浓度罗仙子低分子量多肽提取物。结果显示，与H2O2模型组相比，干预组细胞的凋亡率均显著减低。另外，H2O2模型组中MDA含量明显高于对照组，SOD、CAT和GSH-Px的活性明显降低；应用罗仙子低分子量多肽提取物干预后能够提高SOD、CAT和GSH-Px活性，同时降低MDA含量，提示该低分子量多肽提取物可能通过提高平滑肌细胞的抗氧化酶活力或启动抗氧化相关基因，及时有效地清除氧化应激时产生的过量ROS以及阻断氧自由基传递链，从而减少细胞在过度氧化应激状态下的损伤。该低分子量多肽提取物的成分以及在调节细胞发挥抗氧化功能的具体机制尚有待于进一步探讨。

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(责任编辑:幸建华)

Effect of the lower molecular peptide of housefly(Musca domestica)extractions on the injury of aortic smooth muscle cells induced by H2O2in SD rats

HU Wenlong，CHU Fujiang，ZHENG Xiaoyan，ZHENG Shaoting，LU Xuemei，JIN Xiaobao，ZHU Jiayong (Institute of Pharmaceutical Bioactive Substances Research，Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioactive Pharmaceutical Substances，Guangzhou 510006，China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of the lower molecular peptide of housefly(Musca domestica)extractions(LMPHE)on the oxidative stress injury of SD rat aortic smooth muscle cells (RASMC).MethodsRASMC were isolated，cultured and identified with rabbit anti-α-SM antibody.Then RASMC were divided into five groups including the control group，the model group and three LMPHE-treated groups with different concentrations.The oxidative injury model was established by hydrogen peroxide(H2O2)stimulation.The cell vitality was measured by MTT.The apoptosis of cells was determined by flow cytometry.SOD，CAT，MDA and GSH-Px activities were assayed by micro-plate spectrophotemeter.ResultsThe value of half inhibitory concentration(IC50)to establish oxidative injury model was 480 μmol/mL at 12 hours.The cell vitality was increased in different LMPHE groups compared with the model group(P＜0.05).The activity of MDA was decreased，but the activities of CAT，SOD and GSH-Px were significantly enhanced in all LMPHE groups in comparison with that of the model group.ConclusionLMPHE can protect RASMC from oxidative injury induced by H2O2.

the lower molecular peptide of housefly extractions；rat aortic smooth muscle cells；oxidative stress

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.017

1006-8783(2015)05-0633-05

2015-06-01

国家自然科学基金项目(81274061)；广东省战略性新兴产业核心技术攻关项目(2012A080800016)

胡文龙(1989—)，男，2013级硕士研究生，Email:wenlong＿hu＠hotmail.com；通信作者:朱家勇，男，教授，博士研究生导师，主要从事药用生物活性物质的筛选、结构功能与应用研究，Email:zhujy＠gdpu.edu.cn。

时间:2015-10-16 16:25

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20151016.1625.006.html