环磷酰胺对不同雄性实验动物生殖的影响

郭小元，张旭东，游娟，张娟辉，颜丽云，施文敏，冯秋蓉，唐松山

环磷酰胺对不同雄性实验动物生殖的影响

郭小元1，张旭东2，游娟1，张娟辉2，颜丽云1，施文敏1，冯秋蓉1，唐松山1

(1.广东药学院基础学院，广东广州510006；2.广东武警医院妇产科，广东广州510507)

目的研究环磷酰胺对雄鼠生殖系统的影响，为雄性不孕模型的建立提供实验参考。方法以雄性昆明小鼠、SD大鼠和中华仓鼠为研究对象，每种动物分为生理盐水组和环磷酰胺组。小鼠腹腔给药200 mg/ (kg·周)，共5周；大鼠灌胃给药40 mg/(kg·d)，共4周；仓鼠腹腔给药30 mg/(kg·周)，共5周。各动物每周称质量1次，观察活动情况，计算存活率。建模后，观察睾丸镜下形态学变化。结果环磷酰胺组动物活动度变差，毛发变稀疏，体质量明显降低。小鼠、大鼠和仓鼠环磷酰胺组存活率分别为100%、20% (P＜0.01)和80%(P＜0.05)。镜下检查发现环磷酰胺组睾丸曲精管有空泡，生精细胞排列混乱，管腔内精子减少。结论环磷酰胺可明显引起实验动物睾丸组织损伤。昆明小鼠对环磷酰胺耐受性最高，但睾丸太小，不易观察。SD大鼠非常敏感，死亡率很高。中华仓鼠耐受性良好，睾丸体积较大，适合建立不育模型。

环磷酰胺；睾丸；雄性不孕；中华仓鼠

随着社会的发展，环境污染日益严重，与之俱增的工作压力及长期不良的生活习惯，导致现在不孕不育夫妇的人数越来越多。根据世界卫生组织调查，我国育龄人群中约15%的夫妇患不孕不育症，其中男女双方各占50%[1]。因此寻找更好的治疗手段，开发出更有效的治疗药物对改善当前不孕不育的现状具有重要的意义，而建立良好的不孕不育动物模型将成为医药学研究成功的关键。

文献报道，昆明小鼠、SD大鼠是建立不孕不育实验动物模型的常用动物[2]；主要诱导药物有环磷酰胺[3]、腺嘌呤[4]、达菲林[5]等；给药方式主要是腹腔注射和灌胃[6]。在生物学研究中，小鼠具有遗传结构清晰，繁殖周期短，近交系繁育简便，体型小，实验中通常以腹腔注射的给药方式建立模型[7]，但其睾丸体积较小，不易观察。SD大鼠是一种封闭群鼠，繁殖力强，性周期短而稳定，受孕率较高，实验中通常以胃管给药的方式建立模型[8]。中国仓鼠为小型哺乳动物，体形肥胖，尾较短，吻钝且短，口腔内有颊囊，睾丸较大，特别是其GHRH结构与人有93%同源性，故适用于作为医学不孕不育实验动物模型[9]。环磷酰胺是临床上常用的抗肿瘤药物[10]，对快速增殖的细胞有明显毒性，如睾丸生精能力损害造成精子减少或死精症，因而导致机体不孕不育[11]。本文探讨了环磷酰胺对昆明小鼠、SD大鼠以及中华仓鼠生殖系统的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明小鼠:5周龄雄性SPF级昆明小鼠20只，体质量18～28 g，广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(粤)2013-0020；SD大鼠:8周龄，雄性SD大鼠，16只，体质量180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(粤)2011-0029；中华仓鼠:5周龄雄性中华仓鼠20只，体质量18～22 g，成都达硕动物研究所提供，生产许可证号:SCXK(川)2013-24。

1.1.2 试剂 环磷酰胺，200 mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，0.9%无菌生理盐水，青岛首和金海制药有限公司。

1.1.3 主要仪器 CX31光学显微镜 (日本奥林巴斯)；V9.0明美显微数码成像系统(广州市明美科技有限公司)；电子分析天平(华捷电子仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 昆明小鼠:按完全随机分组，且组间体质量差异无统计学意义。生理盐水组和环磷酰胺组各10只。实验组腹腔注射环磷酰胺，每次给药剂量为200 mg/kg，每周注射1次，共注射5周。生理盐水组仅注射相应量的生理盐水。实验方法参见文献[12]。SD大鼠:按完全随机分组，且组间体质量无差异。生理盐水组和环磷酰胺组各8只，环磷酰胺剂量为40 mg/(kg·d)，灌胃给药4周，生理盐水组给予生理盐水。方法参见文献[13]。中华仓鼠:按完全随机分组，且组间体质量无差异。生理盐水组和环磷酰胺组各10只，以腹腔注射的方式给药，共5周，每周1次，给药剂量为30 mg/kg。实验方法参见昆明小鼠[14]。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 一般指标 动物每周给药前称质量1次，观察动物在建模期间的体质量变化。每天观察动物的活动情况、毛色和身体其他部位是否有异样。统计建模期间动物的存活率。

1.2.2.2 病理切片 昆明小鼠和中华仓鼠喂养5周，SD大鼠喂养4周后，颈椎脱臼处死，取睾丸，称质量，切片，HE染色。观察睾丸切片 HE染色结果。

1.2.3 统计学处理 体质量比较采用t检验，动物存活率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物的一般情况

环磷酰胺组毛色黯淡，活动度变差。与生理盐水组比较，环磷酰胺组体质量增长受到抑制(图1)。由于各动物对环磷酰胺的耐受性不同，存活率有明显差异(图2)。

昆明小鼠:随着环磷酰胺给药时间的增加，小鼠的毛发渐渐变稀疏，活动状态较生理盐水组差。与生理盐水组比较，昆明小鼠在给予环磷酰胺后体质量下降明显，到第 5周差异有统计学意义(P＜0.05)。5周后，生理盐水组和环磷酰胺组动物存活率均为100%，差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 3种动物每周平均体质量比较Figure 1 Changes of body weight in three animals

SD大鼠:随着环磷酰胺给药时间的增加，环磷酰胺组有部分大鼠出现毛色干枯，精神状态不佳，背部弯曲，打嗝，眼、口、鼻、生殖系统以及大便出现出血等症状。环磷酰胺组大鼠的体质量一直呈下降趋势，第4周体质量下降最明显(P＜0.01)。环磷酰胺组大鼠存活率为20%，与生理盐水组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

中华仓鼠:随着环磷酰胺给药时间的增加，仓鼠体毛黯淡无光泽，并伴有脱毛现象，进食减少，大便稀溏，有部分仓鼠常常双眼紧闭，活动性变差。给药5周后，环磷酰胺组与生理盐水组的体质量差异无统计学意义(P＞0.05)，环磷酰胺组动物存活率80%，与生理盐水组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

图2 3种实验动物存活率比较Figure 2 Comparison of survival rates among three animals

2.2 睾丸切片染色分析

见图3。生理盐水组睾丸组织正常，生精小管呈饱满椭圆形，曲细精管上皮细胞排列紧密有序，有3～8层上皮细胞，中央有明显的中空管腔，有明显细胞间质。环磷酰胺组管腔内精子减少，各级生精细胞排列混乱，中空管腔均减小。昆明小鼠环磷酰胺组曲精小管直径减小，间质细胞增多。SD大鼠环磷酰胺组生精上皮脱落及排列紊乱，上皮细胞出现环状间隙，大部分管腔充满脱落的生精细胞，管腔消失。中华仓鼠环磷酰胺组曲细精管疏松分布，各生精小管间隙扩大，间质细胞减少，并有明显肿胀和病理空泡，上皮细胞向管腔扩散，管腔变小。

图3 睾丸光镜观察结果(HE染色，40×)Figure 3 Morphological changes in testis observed by microscope

3 讨论

环磷酰胺为细胞毒性药物，是临床上常用的免疫抑制剂和抗肿瘤药。环磷酰胺对快速生长的细胞产生毒性，如男性睾丸的生精功能障碍，导致无精或少精，诱导精子染色体发生畸变等。国内外有关用环磷酰胺建立动物不孕不育模型的研究报道很多，本研究根据影响因子较高的文献做了大量预实验进行了验证，其结果与报道的结果大相径庭，比如刘志敏等[13]分别以10、20、40、80、100 mg/(kg·d)的剂量，大鼠胃管给药环磷酰胺，喂养4周后发现，40mg/(kg·d)剂量组动物的存活率为93.8%，而本实验结果仅20%。本研究也用80和100 mg/(kg·d)剂量灌胃，但死亡率更高，无法后续研究。根据Tripathi等[12]的研究，本课题组分别以50、100、200 mg/kg剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺，结果显示，各剂量组小鼠存活率100%。由于昆明小鼠睾丸太小，而且后续的治疗化合物为新型生长激素释放激素类似肽(hGHRH类似肽)，通过GHRH同源性分析，中华仓鼠的天然GHRH分子与人GHRH有93%同源性。所以，根据昆明小鼠剂量，本研究用20、30、50、100 mg/kg剂量腹腔注射中华仓鼠作预实验，发现30 mg/kg的剂量为最佳剂量，达到80%成活率。

本实验以腹腔注射或胃管给药的方式建立不孕不育动物模型，建模后达到性成熟期的10周龄昆明小鼠、12周龄SD大鼠和10周龄中华仓鼠作为研究对象，观察环磷酰胺对实验动物睾丸的影响。从实验结果可以看出，环磷酰胺能引起雄鼠睾丸生殖细胞增殖抑制，随剂量增高，毒副作用增强。给药方式对实验结果也有很大影响，灌胃给药对鼠口腔、胃肠和生殖器的刺激性较大，出现口腔、生殖器和大便出血。

本实验结果表明，雄性昆明小鼠、SD大鼠和中华仓鼠经过环磷酰胺给药后，动物体质量增长受到抑制，随剂量增高引起中毒表现更明显，活动性变差、毛发变得干枯。与生理盐水组相比，体质量增长受到抑制。在镜检中发现，曲精管肿胀、空泡和畸变率增加。与昆明小鼠和SD大鼠相比，中华仓鼠更适合作为后续实验的不孕不育模型，因为中华仓鼠睾丸体积较大和其GHRH分子与人同源性高等特点，降低了实验种族差异，这对药物的临床实验提供更可靠的前提。睾丸病理切片显示，中华仓鼠的睾丸病理变化比其他两种鼠明显，更易观察。综上所述，环磷酰胺腹腔注射中华地鼠建立不孕不育动物模型可行，而且动物体积小，给药量小，操作简单，造模时间短，造模成功率高。

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(责任编辑:幸建华)

Effect of cyclophosphamide on different male experimental animals

GUO Xiaoyuan1，ZHANG Xudong2，YOU Juan1，ZHANG Juanhui2，YAN Liyun1，SHI Wenmin1，FENG Qiurong1，TANG Songshan1
(1.School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Department of Obstetrics＆Gynecology，Guangdong Provincial Corps Hospital，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510507，China)

ObjectiveTo explore the impact of cyclophosphamide on the reproductive system of male animals.MethodsThe Kunming male mice，SD rats and Chinese hamsters were divided into saline and cyclophosphamide groups.Mice were intraperitoneally injected cyclophosphamide with 200 mg/kg every week for five weeks.SD rats were intragastrically administered cyclophosphamide with 40 mg/kg every week for four weeks.Hamsters were intraperitoneally injected cyclophosphamide with 30 mg/kg every week for five weeks.All animals were weighed per week.Their general activities and fur colors were observed and their survival rates were recorded.After the animals were modeled，the morphology of testis was observed under microscope.ResultsCompared with the saline animals，the activities of animals in the cyclophosphamide group were weak，their furs became thin and their weights were reduced significantly.The survival rates of KM mice，SD rats，and hamster were 100%，20%and 80%，respectively.The seminiferous tubules displayed vacuoles and swelling.The arrangement of spermatogenic cells was in chaos and sperms in seminiferous tubules became less.ConclusionCyclophosphamide can cause significant damages to the animal testicles. Kunming mice have strong tolerance to cyclophosphamide，but their testes are very small.SD rats are very sensitive to cyclophosphamide.The tolerance of Chinese hamsters is stronger and their testes are larger and easy to observe.So the hamsters are adequate to establish the animal models.

cyclophosphamide；testis；male infertility；Chinese hamsters

R285.5

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.018

1006-8783(2015)05-0638-04

2015-05-15

国家自然基金项目(81001391)；广东省自然基金项目(2014A030313589，2015A030313843)；教育部留学基金项目(44143012)

郭小元(1988—)，女，2013级硕士研究生；通信作者:唐松山(1965—)，男，教授，硕士生导师，主要从事内分泌肽原蛋白蛋加工和临床疾病研究，Email:songstang＠hotmail.com。

时间:2015-09-24 15:58

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1558.002.html