运动干预对大鼠多囊卵巢综合征发生的影响

操思凡，吴敏敏，蒋立艳

运动干预对大鼠多囊卵巢综合征发生的影响

操思凡1，吴敏敏1，蒋立艳2，3

(广东药学院1.公共卫生学院；2.临床医学院；3.附属第一医院，广东广州510000)

目的研究运动干预对大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)发生的影响，评估暴露早期的运动干预对预防PCOS的作用。方法30只6周龄SD雌性大鼠随机分为3组，每组10只。对照组灌服溶剂自然生长，模型组和预防组采用来曲唑法造模。预防组从造模开始同时接受运动干预。放射免疫法测大鼠血清性激素、空腹胰岛素、瘦素，全自动生化仪测血脂、空腹血糖，HE染色观察卵巢组织学变化。结果与对照组相比，模型组大鼠肥胖，动情周期紊乱，卵巢内出现大量囊状卵泡；血清睾酮(T)、黄体生成素(LH)、空腹胰岛素(FINS)、瘦素(Leptin)水平升高(P＜0.05)，孕酮(P)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)水平下降(P＜0.05)。预防组大鼠体质量和动情周期正常，卵巢内可见各级正常卵泡；T、LH、FINS、Leptin浓度较模型组降低(P＜0.05)，FSH、E2浓度升高(P＜0.05)；P浓度较模型组升高(P＜0.05)；高密度脂蛋白(HDL)水平显著升高，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论早期适量的运动干预可以降低多囊卵巢综合征模型大鼠雄激素水平，减轻胰岛素抵抗，促进排卵，阻止PCOS发生；同时具有保护心血管的功能，是预防PCOS的有效措施。

多囊卵巢综合征；大鼠模型；运动干预；预防

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种育龄妇女常见的生殖、内分泌与代谢紊乱综合征，主要表现为月经紊乱、不孕、多毛、胰岛素抵抗、高雄激素血症和血脂异常[1]。患者下丘脑-垂体-卵巢轴功能异常，存在心血管疾病、Ⅱ型糖尿病和子宫内膜癌高发的远期危险[2-4]。PCOS的病因仍不确切，研究表明其可能由某些遗传因素与环境因素共同作用引起。目前PCOS尚无有效药物治疗，生活方式调整(lifestyle modification，LSM)是其治疗首选[5]，包括合理饮食和运动。研究表明运动能有效缓解PCOS症状，改善妊娠结局[6-7]。但是，在疾病尚未发生时针对危险因素采取“一级预防”，才是预防和消灭疾病的根本措施[8]，而PCOS领域至今未见此类研究报道。因此，本研究以疾病预防为目的，探讨运动能否作为PCOS的一级预防措施。由于人群干预试验受到伦理学和可行性的限制[9-10]，本实验采用动物实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄SPF级SD雌性大鼠，体质量166.5～192.5 g，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号:SCXK(粤)2013-0002。

1.2 主要试剂

来曲唑片(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字 H19991001)；羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC，美国Sigma公司)；生化检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)；放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)。

1.3 动物模型的构建

将30只6周龄雌性SD大鼠进行随机分组，每组10只，分别为对照组、PCOS模型组和预防组，3组大鼠初始体质量差异无统计学意义(P＞0.05)。使用来曲唑法诱导PCOS大鼠模型[11]:将来曲唑溶于1%(ρ)羧甲基纤维素(CMC)中，对模型组大鼠进行1 mg/(kg·d)来曲唑连续灌胃21 d；预防组大鼠同样进行1 mg/(kg·d)来曲唑连续灌胃21 d，模拟PCOS暴露，同时每日进行运动干预；对照组大鼠连续21 d等量CMC灌胃。每日定时称大鼠质量和阴道涂片。

1.4 阴道涂片

每日上午9时，用棉签蘸取少量生理盐水，插入大鼠阴道旋转一圈，涂抹于干净载玻片。瑞氏-吉姆萨染色后，蒸馏水冲洗，置于镜下观察。

1.5 运动干预

采用 Masashi的游泳法[12]:将大鼠置于水深50 cm，水温35℃的桶中进行无负荷自由游泳运动，每周运动6 d，每天运动120 min。每次运动时将鼠笼置于大鼠游泳的水桶旁，摒除环境的影响。

1.6 实验取材及指标检测

末次灌胃后予以各组大鼠自由饮水并禁食12 h，3%(φ)戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于自制的手术台上，打开腹腔与胸腔，心脏取血5 mL并迅速剥离双侧卵巢，去除表面结缔组织，称重，保存于10% (φ)甲醛溶液中，用于 HE染色。待血清析出后2 000 r/min离心10 min分离血清，于-30℃冰箱保存待检。

放射免疫法测定血清空腹胰岛素(FINS)、瘦素(Leptin)、睾酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)浓度；全自动生化仪测定空腹血糖(FBG)、血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。

卵巢指数＝卵巢质量(mg)/大鼠体质量(g)[13]。

1.7 卵巢组织学观察

每只大鼠的一侧卵巢做病理切片，从卵巢中心沿最长轴在面积最大处进行连续切片，切片厚度为4 μm，HE染色，选择其中面积最大的3张进行分析，光镜下观察卵巢组织学形态变化，显微成像系统采集照片。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠体质量和卵巢质量变化

模型组体质量显著高于对照组和预防组(P＜0.05)，预防组和对照组体质量差异无统计学意义。模型组卵巢质量和卵巢指数显著大于对照组和预防组(P＜0.05)，预防组和对照组的卵巢质量及卵巢指数差异无统计学意义。见表1。

表1 3组大鼠体质量和卵巢质量比较Table 1 Comparison of body and ovary weight in three groupsof rats(±s，n＝10)

表1 3组大鼠体质量和卵巢质量比较Table 1 Comparison of body and ovary weight in three groupsof rats(±s，n＝10)

与对照组比较:∗P＜0.05；与模型组比较:＃P＜0.05。

组别 体质量/ g卵巢质量/ mg卵巢指数/ (mg·100 g－1)对照组 264.2±19.24 48.57±1.52 18.44±0.94模型组 306.0±36.43∗62.14±1.98∗20.52±2.12∗预防组 247.7±8.83＃49.49±1.91＃18.61±0.32＃

2.2 大鼠卵巢形态学变化

对照组大鼠卵巢色泽呈淡粉色，表面可见较多黄体；模型组卵巢色泽苍白，体积较对照组明显增大，表面见透亮的囊泡，罕见黄体；预防组卵巢色泽粉红，表面有较多实质的黄体。

2.3 大鼠动情周期变化

对照组大鼠有4～5 d的规律动情周期，由动情间期进入动情前期、动情期和动情后期，再过渡到动情间期，开始下一个循环；模型组大鼠灌胃数天后失去规律的动情周期，始终处于动情间期，无排卵，阴道涂片示大量白细胞，偶见有核上皮细胞和角化细胞；预防组大鼠经由短暂的动情周期紊乱，从干预的第7天起逐渐恢复为规律的动情周期。见图1。

2.4 大鼠血清学指标

2.4.1 血清性激素水平比较 模型组大鼠血清T、LH浓度显著高于对照组，P、E2、FSH浓度显著低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；预防组大鼠血清T、LH浓度明显低于模型组，E2、FSH浓度显著高于模型组，P浓度明显高于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 3组大鼠血清性激素比较Table 2 Comparison of serum sex hormones in three groups of rats(±s，n＝10)

表2 3组大鼠血清性激素比较Table 2 Comparison of serum sex hormones in three groups of rats(±s，n＝10)

与对照组比较:∗P＜0.05；与模型组比较:＃P＜0.05。

组别 ρ(T)/(ng·L－1) ρ(P)/(ng·L－1) ρ(E2)/(pg·L－1) ρ(LH)/(mIU·L－1) ρ(FSH)/(mIU·L－1)对照组 0.85±0.65 7.54±0.87 11.00±2.04 4.41±1.02 1.51±0.34模型组 3.47±1.44∗3.11±0.71∗4.52±1.01∗6.85±0.95∗0.74±0.37∗预防组 1.03±0.38＃5.21±1.68∗＃7.58±1.65＃5.37±0.87＃1.29±0.21＃

2.4.2 血脂、血糖、胰岛素和瘦素水平比较 模型组大鼠FINS、Leptin水平高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。预防组大鼠FINS、Leptin、TG水平低于模型组，HDL水平高于模型组并高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。FBG、TC、LDL在3组间差异无统计学意义。见表3。

图1 大鼠动情周期(瑞氏-吉姆萨染色，200×)Figure 1 Estrous cycles of rats(Wright-Giemsa staining，200×)

2.5 大鼠卵巢形态学和组织学变化

大体标本观察发现，预防组卵巢大小与对照组接近，明显小于模型组卵巢；镜下观察卵巢组织发现:对照组大鼠卵巢内部包含多个黄体及不同发育阶段的各级卵泡(包括原始卵泡、初级卵泡、小窦前卵泡、大窦前卵泡、窦状卵泡、优势卵泡等)，闭锁卵泡少，卵母细胞清晰，颗粒细胞多。模型组大鼠卵巢内初级卵泡和闭锁卵泡增多，并有大量特征性的囊状扩张卵泡，囊内未见卵母细胞及放射冠等基本结构，颗粒细胞层数明显减少至1～3层，且卵泡膜增厚，间质细胞增生明显，各阶段发育卵泡均少见，罕见成熟卵泡和黄体。预防组大鼠卵巢内多见窦状卵泡，偶有特征性囊状扩张卵泡，但有大量各级正常卵泡存在，包括成熟卵泡，并具有相当数量的黄体，未出现明显的间质增生。

表3 3组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、瘦素和血脂比较Table 3 Comparison of fasting glucose and insulin，leptin and blood lipids in three groups of rats(±s，n＝10)

表3 3组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、瘦素和血脂比较Table 3 Comparison of fasting glucose and insulin，leptin and blood lipids in three groups of rats(±s，n＝10)

与对照组比较:∗P＜0.05；与模型组比较:＃P＜0.05。

组别 c(FBG)/ (mmol·L－1) ρ(FINS)/ (mIU·L－1) ρ(Leptin)/ (ng·mL－1) c(TC)/ (mmol·L－1) c(TG)/ (mmol·L－1) c(HDL)/ (mmol·L－1) c(LDL)/ (mmol·L－1)对照组 8.47±0.49 22.43±2.35 0.14±0.04 2.06±0.36 0.95±0.34 0.40±0.02 0.18±0.02模型组 8.53±1.30 45.86±12.46∗0.44±0.14∗1.82±0.41 1.09±0.15 0.35±0.06 0.17±0.02预防组 8.10±1.14 30.45±4.93＃0.27±0.14＃1.45±0.04 0.52±0.13＃0.45±0.05∗＃0.14±0.01

图2 3组大鼠卵巢组织学变化(HE染色，200×)Figure 2 Pathological changes of ovary tissue in three groups of rats(haematoxylin-eosin staining，200×)

3 讨论

PCOS是育龄期妇女最常见的内分泌和代谢紊乱性疾病，人群发病率为6%～7%，临床表现有很高的异质性和远期并发症风险[14]。除针对临床症状的对症治疗，目前还没有任何一种药物可以一劳永逸地治疗PCOS，采取有效的预防措施是降低发病率的关键。

本实验采用来曲唑法造模。来曲唑是一种芳香化酶抑制剂，可阻断机体内雄激素向雌激素转化，使内源性雄激素升高，是其诱导PCOS模型的理论基础[15]。实验在PCOS运动干预疗法的基础上，首次探讨运动干预的预防效果。在预防组大鼠接受来曲唑灌胃的同时进行运动干预，并与PCOS模型组和对照组大鼠进行比较，评估暴露早期的运动干预能否作为一级预防手段阻止PCOS发生。

实验结果显示，模型组大鼠始终处于动情间期，稀发排卵或无排卵。与对照组相比，模型组大鼠T、LH浓度显著升高，P、E2、FSH浓度显著降低，卵巢内出现大量颗粒细胞层明显减少的特征性囊状扩张卵泡。依据鹿特丹诊断标准[16]，证实PCOS造模成功。同时，模型组大鼠体质量和卵巢质量明显高于对照组，与临床上PCOS患者多数伴发肥胖的现象一致。另外，模型组大鼠存在瘦素和胰岛素抵抗，与文献报道一致[17-19]。接受21 d运动干预的预防组大鼠未出现上述症状，且生理生化指标较模型组大鼠有很大改变:从运动干预的第7天起，预防组大鼠由动情间期逐渐恢复规律的动情周期；干预结束后，卵巢内可见大量各级发育卵泡，并有相当数量的黄体，囊状扩张卵泡罕见，提示预防组大鼠基本恢复排卵功能。相比于模型组，预防组大鼠血清T、LH水平显著降低，FSH水平升高，均达到正常水平，P、E2浓度也大幅升高。大鼠未发生肥胖，卵巢质量也小于模型组。FINS、Leptin、TG水平均降低至正常水平，HDL水平升高并超过对照组水平。分析预防组大鼠发生作用的原因可能是由于运动提高了肌肉组织对胰岛素的敏感性，减轻胰岛素抵抗，从而降低血中雄激素水平。低水平的胰岛素又减轻了其对垂体的直接刺激，减少LH分泌，避免卵泡膜细胞合成过多雄激素，降低卵巢内雄激素水平。运动通过影响下丘脑-垂体-卵巢轴，负反馈增强了FSH的分泌，使得原本受到来曲唑抑制的芳香化酶重新或部分激活，促进卵巢的雌激素合成。这样，在内源性雄激素水平降低、卵巢内雌激素升高的条件下，促进优势卵泡的发育直至成熟后排卵，保证了黄体的形成和高水平孕酮的释放，最终恢复正常的卵巢组织学形态和功能。另外，由于运动时肾上腺素、去甲肾上腺素分泌增加，脂蛋白酯酶活性升高，加速脂肪分解，从而减轻体质量，降低血中TG和LDL浓度，提高HDL浓度，减少脂肪在心脏、血管和肝脏等器官的沉积，预防心脑血管病变[20]。

综上所述，在暴露于来曲唑的情况下，早期适量的运动干预能够降低大鼠的雄激素水平，促进排卵，减轻胰岛素抵抗，阻止PCOS发生，同时具有保护心血管的功能，是预防PCOS的有效措施，但其具体作用机制还有待进一步研究。

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(责任编辑:幸建华)

Effect of exercise intervention on the occurrence of polycystic ovary syndrome in rats

CAO Sifan1，WU Minmin1，JIANG Liyan2，3
(1.School of Public Health；2.School of Clinical Medicine；3.First Affiliated Hospital，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510000，China)

ObjectiveTo study the impact of exercise intervention on the occurrence of polycystic ovary syndrome(PCOS)and assess the effect of early intervention as a preventive method of PCOS.Methods30 SD rats were randomly divided into three groups，with 10 rats in each group.The control group wasn’t treated.The model and prevention groups were administrated with letrozole to induce PCOS.The prevention group was also accepted exercise intervention.Serum sex hormone，fasting insulin and leptin were detected by radioimmunoassay.Blood lipids and fasting glucose were measured by automatic biochemical analyzer. The pathological changes of ovary tissue were observed by using haematoxylin-eosin staining.ResultsCompared with the control group，the model group rats were fat and had disordered estrous cycles，and large numbers of cystic follicles were observed in ovaries.The concentrations of serum testosterone(T)，luteinizing hormone(LH)，fasting insulin(FINS)and leptin were significantly increased，but the levels of progesterone(P)，estradiol(E2)and follicle stimulating hormone(FSH)markedly decreased.The differences were statistically significant(P＜0.05).The rats in the prevention group were non-obese and had normal estrous cycles，with all kinds of developing follicles in their ovaries.The concentrations of T，LH，FINS and leptin were notably decreased compared to the model group，but FSH and E2levels were dramatically increased(P＜0.05).The concentration of P was promoted compared to the model group，but still lower than the control(P＜0.05).HDL level was prominently elevated and even exceeded the control(P＜0.05).ConclusionThe early intervention with moderate exercise can reduce androgen level and insulin resistance in PCOS rats，promote ovulation and restrain PCOS from happening.It can protect cardiovascular system functions as well，which means an effective measure of preventing PCOS.

polycystic ovary syndrome；rat model；exercise intervention；prevention

R711.75

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.022

1006-8783(2015)05-0656-05

2015-06-11

广东省医学科研基金项目(A2015424)；广东大学生科技创新培育专项资金自然科学类一般项目(156012)

操思凡(1990—)，女，2013级硕士研究生，Email:happy＿csf＠msn.com；通信作者:蒋立艳(1966—)，女，副教授，主要从事不孕症、卵巢肿瘤及滋养细胞疾病研究，Email:jlyby＠sina.com。

时间:2015-09-24 16:06

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150924.1606.006.html