六君子汤对食管癌细胞株EC9706致血管生成的影响

周 凌， 尹素改， 吴耀松， 王慧慧， 陈玉龙

（河南中医学院分子生物实验中心，河南郑州450046）

六君子汤对食管癌细胞株EC9706致血管生成的影响

周 凌， 尹素改， 吴耀松， 王慧慧， 陈玉龙*

（河南中医学院分子生物实验中心，河南郑州450046）

目的研究六君子汤对食管癌血管生成的影响。方法MTT法检测六君子汤醇提物对食管癌细胞株EC9706生长抑制作用，收集其500μg/mL质量浓度的EC9706细胞条件培养基用于鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成、人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成的观察。ELISA法检测EC9706细胞和人脐静脉内皮细胞培养基上清中VEGF和IL-6含有量。结果六君子汤醇提物可明显抑制EC9706细胞增殖，具一定剂量依赖性，其IC50值为505.28μg/mL。六君子汤醇提物可减少EC9706细胞条件培养基所致鸡胚绒毛尿囊膜血管生成、人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成。六君子汤醇提物可减少EC9706细胞和内皮细胞IL-6及内皮细胞VEGF分泌。结论六君子汤醇提物可能通过干预EC9706细胞信号通路从而抑制血管生成的效应。

六君子汤；食管癌细胞株EC9706；人脐静脉内皮细胞；鸡胚绒毛尿囊膜；血管生成；VEGF；IL-6

六君子汤是治疗或辅助治疗肿瘤的有效方剂。研究表明，该方能够抑制H22小鼠肝癌移植瘤生长，增加体质量、延长存活时间，诱导肺癌细胞SPA-A1和胃癌细胞BGC2823凋亡［1-2］。对人食管癌细胞株Eca109和人肝癌细胞株HepG2的生长有不同程度抑制作用，具有明显剂量依赖性［3］。临床观察表明，它可以减轻放化疗引起的恶心、呕吐、食欲减退、白细胞减少等毒性作用，提高外周血淋巴细胞转化率、NK细胞活性、辅助T细胞与抑制T细胞比率等免疫指标。应用该方治疗进展期胃癌，能改善生活质量，稳定肿瘤病灶，延长生存期［4-5］。肿瘤血管生成是决定肿瘤生长、转移、复发及预后的关键因素之一。六君子汤是否可以抑制食管癌血管生成，尚未见报道，因此本实验对此进行研究。

1 材料

1.1 药物 六君子汤参照 《医学正传》组方，药物组成与比例为人参-白术-茯苓-甘草-陈皮-半夏（2∶3∶2∶2∶2∶3）；药物购于河南中医学院三附院，经河南中医学院苗艳艳副研究员鉴定为真品。1.2 细胞株和受精种蛋 人食管癌细胞株EC9706，由河南中医学院分子生物实验中心提供；人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECS）第4代，购于北京北纳创联生物技术研究院；受精种蛋，购于郑州市惠济区丰乐农庄。

1.3 试剂 RPMIMedium 1640、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶消化液、四甲基偶氮唑蓝MTT（北京索莱宝科技有限公司）；二甲基亚砜DMSO（美国Amresco公司）；四季青胎牛血清（北京雅安达生物技术有限公司）；Matirgel基质胶（美国BD公司）；血管内皮细胞生长因子ELISA试剂盒；人白介素-6 ELISA试剂盒（中国Boste公司）。

1.4 仪器设备 Heraeus细胞培养箱（德国Kendro公司）；倒置显微镜 （德国ZESS公司）；紫外分光光度计BioMate（美国Thermo Fisher Scientific公司）；SG-603生物安全柜 （美国Bake公司）；ELx800型酶标仪（美国BioTek公司）；3422型Transwell小室（美国Corning公司）；微电脑全自动孵化机（德州爱华孵化设备厂）；OlympusSZ61变焦体视显微镜（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 药物提取 药量按照上述比例称取每味药物对等克数，质量∶体积=1∶10加入85%乙醇浸泡7 d，每日震荡两次，混匀。用旋转蒸发仪浓缩药液，真空干燥箱干燥。DMSO充分溶解配置100 mg/mL的母液，0.22μm过滤除菌，-20℃冰箱保存，备用。

2.2 细胞培养 EC9706细胞和人脐静脉内皮细胞株HUVECS于含10%胎牛血清完全培养基培养，置于37℃饱和湿度，体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，2～3 d换液一次，细胞长到80%时传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

2.3 细胞生长抑制作用 以1×104EC9706细胞/孔接种96孔平面培养板，于37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养24 h。设对阴性照组、六君子汤药物组 （质量浓度分别为2 000、1 600、1 280、1 024、820、654μg/mL），每组4个复孔，阴性对照组培养基为完全培养液及与用药组相等剂量的DMSO。继续培养48 h，加入MTT，4 h后DMSO溶解，用酶标仪在波长为570 nm（/630 nm），测定吸光度 （A）。按公式计算抑制率。抑制率=（1-实验孔平均 A570/630值/对照孔平均A570/630值） ×100%。

用同样方法，检测 “2.4”项条件培养基对人脐静脉内皮细胞HUVECS抑制作用。

2.4 条件培养基制备 以1×106EC9706细胞/孔接种φ100培养皿，于37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养 24 h，加入六君子汤 500 μg/mL，阴性对照为完全培养基。继续培养48 h。收集上清，离心，-20℃冰箱保存备用。

2.5 EC9706细胞条件培养基对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响 新鲜受精种蛋，消毒，气室向上，放入37.8℃、相对湿度65%培养箱中，每2 h翻转1次；7日龄的种蛋标记气室；8日龄的鸡胚在蛋壳钝端开小孔约0.2～0.3 mm，暴露胚绒毛尿囊膜（Chick embryo chorioallantoicmembrane，CAM），用医用敷贴封闭气室端，放入孵化箱继续培养。开窗后第2天，将制备好的厚约2 mm的硅胶片置于每枚鸡胚CAM表面两条主干血管 （卵黄静脉）之间相对无血管区。将种蛋随机分为4组，即空白对照组 （培养基）、肿瘤条件培养基组、六君子汤条件培养基组，每组10只。加上述液体于载体上，20μL/胚，封口，放入孵化箱继续培养。孵育至第11天，揭去医用敷贴，假气室内加入甲醇、丙酮按1∶1比例混合后的混合液固定，最大程度暴露CAM，以载体为中心用眼科剪完整剪下CAM，平铺于加有固定液的培养平皿中。解剖显微镜（10倍）下拍照，用Image-pro plus软件对照片进行处理，选取以实际面积计为1.5 cm× 1.5 cm大小的尿囊膜，以测定吸光度 （A）反映血管面积。

2.6 EC9706细胞条件培养基对HUVECS迁移的影响 取细胞悬液3×104个/孔加入Transwell 24孔板上室，24孔板下室加入500μL/孔高糖DMEM完全培养基，每组设置3个复孔，即空白对照组、肿瘤条件培养基组、六君子汤条件培养基组，继续培养。24 h后将板从培养箱中取出，于超净台内吸出孔内药液，用棉签将上室内细胞擦去，下室每孔加入MTT，4 h后DMSO溶解，用酶标仪在波长为570 nm（/630 nm），测定吸光度 （A）。

2.7 EC9706细胞条件培养基对HUVECS小管生成的影响 Matrigel基质胶4℃过夜冻融，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状，1∶3无血清的高糖DMEM培养基稀释，将96孔培养板置于冰上，加入浓度为50μL/cm2生长面积的Matrigel基质胶，在37℃放置30 min成胶。按细胞悬液2×104个/孔加入板中，放入 CO2培养箱培养24 h。分为空白对照组、肿瘤条件培养基组、六君子汤条件培养组，加入上述液体，每组设置5个复孔。CO2培养箱培养6 h。光学显微镜下观察内皮细胞小管的形成情况，每孔随机取5个视野，数码相机拍照，计数形成的小管的个数。

2.8 六君子汤对HUVECS、EC9706细胞株分泌IL-6和VEGF水平的影响 以1×106EC-9706细胞/孔、1×106HUVECS细胞/孔接种于φ100培养皿，于37℃，5%CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养24 h，加入六君子汤500μg/mL，阴性对照为完全培养基。继续培养48 h。收集上清，离心，-20℃冰箱保存备用。

严格按照ELISA说明书进行，往预先包被待测样品的包被微孔中，依次加入标本 （上述各组培养基上清）、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤，TMB显色，于酶标仪上在450 nm测吸光度 （A）。

2.9 统计学分析 实验数据以x±s表示，使用SPSS 17.0数据统计软件进行ANOVA方差分析后，再进行LSD-t检验，测P＜0.05有统计学意义，回归分析进行曲线拟合，应用概率法计算半数抑制率。

3 结果

3.1 六君子汤对人食管鳞癌细胞EC9706增殖的抑制作用 六君子汤各质量浓度组作用EC9706细胞48 h后，抑制率随质量浓度的增加而增加，呈现一定的量效关系，方程为：4.6×10-7x2+ 0.001 523x-0.270 66，（r2=0.980，F=75.107，P=0.001），应用概率法 95%置信区间 IC50： 505.28μg/mL。结果见表1。

表1 六君子汤对人食管鳞癌细胞EC9706增殖的抑制作用（x±s）Tab.1 Inhibitory effects of Liujunzi Decoctionon on the proliferation of esophageal cancer line EC9706（x±s）

以下实验只以药物 IC50为用药剂量：500 μg/mL

3.2 食管鳞癌EC9706细胞六君子汤条件培养基对CAM血管生成的影响 与空白对照组相比，肿瘤条件培养基明显增加CAM血管面积，而500 μg/mL六君子汤条件培养基可以明显减少血管生成，和肿瘤条件培养基比，有显著差异，结果见表2。

表2 不同组别对CAM血管生成的影响（x±s）Tab.2 Effect of d ifferent groups on CAM angiogenesis（x±s）

3.3 人食管鳞癌EC9706细胞六君子汤条件培养基对人脐静脉内皮细胞株HUVECS增殖的抑制作用 空白对照组、六君子汤条件培养基组A值明显低于与肿瘤条件培养基组 （P＜0.05），六君子汤条件培养基组A值低于空白对照组 （P＜0.05）。结果见表3。

表3 不同组别对人脐静脉内皮细胞株HUVECS增殖的影响（n=4，x±s）Tab.3 Effect of different groups on the proliferation of hum an umbilical vein endothelial cell HUVECS（n=4，x±s）

3.4 人食管鳞癌EC9706细胞六君子汤条件培养基对人脐静脉内皮细胞株HUVECS迁移的抑制作用 各组HUVECS细胞于Transwell小室实验发现，肿瘤条件培养基组的细胞迁移量较空白对照组有明显的增加 （P＜0.05），六君子汤条件培养组的细胞迁移量较肿瘤条件培养基组有轻微的抑制作用（P＜0.05）。结果见表4。

表4 不同组别对人脐静脉内皮细胞株HUVECS迁移的影响 （x±s）Tab.4 Effect of different groups on themigration of human umbilical vein endothelial cell HUVECS（x±s）

3.5 人食管鳞癌EC9706细胞六君子汤条件培养基对人脐静脉内皮细胞株HUVECS小管形成的抑制作用 空白对照组小管形成个数明显低与肿瘤条件培养基组，两者相比有显著统计学差异 （P＜0.01）；六君子汤条件培养基组明显低于肿瘤条件培养基组 （P＜0.01），见表5。

表5 不同组别对人脐静脉内皮细胞株HUVECS小管形成的影响 （x±s）Tab.5 Effect of different groups on the tube formation of hum an um bilical vein endothelial cell HUVECS（x±s）

3.6 不同质量浓度六君子汤对EC9706细胞和人脐静脉内皮细胞株HUVECS分泌VEGF和IL-6的影响 见表6。

表6 六君子汤对EC9706和HUVECS细胞分泌VEGF和IL-6的影响（n=3，x±s）Tab.6 E ffects of different groups on the VEGF and IL-6 secretion of EC9706 and HUVECS cells（n=3，x±s）

4 讨论

食管癌是常见的恶性肿瘤之一，我国每年约有25万新诊断的食管癌病例，占全世界食管癌病例数的一半，预后较差，五年生存率不到15%［6］。研究发现，食管癌肿瘤微血管密度 （MVD）值与肿瘤侵袭和转移呈正相关，与生存时间呈负相关［7］，因此本实验围绕食管癌细胞EC9706致血管生成对六君子汤进行了研究。

首先，本实验从肿瘤细胞增殖角度着手，发现六君子汤不同质量浓度作用48 h后可以明显抑制EC9706细胞增殖，且随药物浓度的增加而升高，呈剂量-效应依赖关系。与文献［3］相比，虽然药物提取方法不同，结果趋势一致，说明六君子汤水溶成分和醇溶成分都有一定抑制食管癌增殖作用。值得一提是，用以溶解醇提物的溶剂DMSO在大于1%时对细胞增殖有一定影响［8］（预实验，结果未显示），因此本研究在做细胞抑制试验时分别用含有和用药组等剂量DMSO完全培养基做对照组；但是在条件培养基制备时，由于DMSO含量为0.5%，对细胞没有影响，因此对照组所用为完全培养基。

肿瘤引起血管生成依赖于肿瘤细胞产生的各种生长因子及调控血管周围环境和内皮细胞增殖、迁移的各类分子，如VEGF、bFGF、IL-6、MMP-9等［9］。为了研究EC9706细胞所产生分子对血管生成的影响，制备了EC9706细胞条件培养基，并进行以下实验。

鸡胚绒毛尿囊膜模型 （CAM）是常用的血管生成实验体内模型［10］，本实验观察到EC9706细胞条件培养基可显著增加CAM生成的血管总面积，而用六君子汤干预后的EC9706细胞条件培养基可减少CAM血管生成，说明六君子汤可以通过抑制EC9706细胞释放某些促进血管生成的分子。

血管生成过程包括机制降解、内皮细胞增殖、迁移、血管形态形成［11］。为了进一步研究六君子汤作用机制，本实验发现EC9706细胞条件培养基可以显著增加人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成，而用六君子汤干预后的条件培养基，内皮细胞的这些生物行为明显减弱，说明六君子汤可抑制EC9706细胞分泌的分子效应是多方面。

由于VEGF和IL-6表达和食管癌的浸润、转移及预后密切相关，并在血管生成过程中发挥重要作用［12-13］，本实验对六君子汤对EC9706细胞和脐静脉内皮细胞分泌此两个分子影响进行了观察，发现六君子汤虽然不能够减少EC9706细胞分泌VEGF，但能显著减少脐静脉内皮细胞分泌该分子，并能减少两类细胞分泌IL-6。由此可知，六君子汤对内皮细胞和EC9706细胞作用不同，其减少肿瘤和内皮细胞IL-6和VEGF分泌可能是它抑制肿瘤所致血管生成分子机制之一。

总之，六君子汤可抑制肿瘤所致内皮细胞增殖、迁移和小管形成，从而抑制血管生成，并可能通过对肿瘤和内皮细胞分泌VEGF和IL-6的干预发挥作用，但由于肿瘤所致血管生成分子机制复杂，六君子汤的作用分子机制需进一步研究。

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Effect of Liujunzi Decoction on angiogenesis of esophageal cancer cell line EC9706

ZHOU Ling， YIN Su-gai， WU Yao-song， WANG Hui-hui， CHEN Yu-long*
（Molecular Biological Experiment Center of Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

AIMTo study the effects of Liujunzi Decoction on the angiogenesis of esophageal cancer cell line EC9706.METHODSThe inhibitory effect of Liujunzi Decoction alcohol extract on proliferation of EC9706 was detected by MTT assay.500μg/mL of EC9706 cell conditioned media in Liujunzi Decoction was collected and used to observe the angiogenesis of chick embryo chorioallantoic membrane（CAM），proliferation migration and tube formation of human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.VEGF and IL-6 level in culturemedium supernatantof EC9706 cells and HUVECSwere detected by ELISA.RESULTSLiujunziDecoction alcohol extract could inhibit the proliferation of EC9706 cellswith IC50 value of505.28μg/mL in a dose dependentmanner，and markedly reduce the elevation in the angiogenesis of CAM，HUVECs proliferation，migration and tube formation caused by EC9706 cell conditioned medium.It also decreased both IL-6 level from EC9706 and HUVECs and VEGF level from HUVECs in serum.CONCLUSIONLiujunzi Decoction alcohol extract can inhibit the angiogenesis through intervening secretion of EC9706 cell signal pathway.

Liujunzi Decoction；esophageal cancer cell line EC9706；human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）；chicken embryo chorioallantoic membrane（CAM）；angiogenesis；VEGF；IL-6

R285.5

：A

：1001-1528（2015）06-1165-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.003

2014-08-18

国家自然科学基金资助项目 （81173177）；河南省教育厅科学自然基金项目 （2010B36004）；郑州市科技局项目（10PTGS486-10）

周 凌 （1988—），女，硕士，研究方向为肿瘤的病机与防治。Tel：（0371）56676982

*通信作者：陈玉龙 （1973—），男，博士，教授，研究方向为肿瘤的病机与防治。Tel：（0371）65680206，E-mail：cyl72621@ 163.com