LPS 对5 -FU 杀伤QBC939 细胞影响的实验研究

霍胜军 吕忠诚 邹晓鹤 宋建文 王 康

化疗是目前恶性肿瘤的治疗中不可缺少的一种治疗手段，但癌细胞对化疗药物的耐药性却是临床治疗中较为棘手的问题。研究表明，CXCR4 在胆管癌中有表达，并与肿瘤的转移、预后相关，CXCR4 基因的抑制剂LPS 可以抑制CXCR4 蛋白的表达，从而抑制胆管癌细胞株QBC939 的增殖，诱导凋亡，抑制其侵袭能力试验［1，2］。对白血病、乳腺癌等的研究表明，CXCR4 基因的单克隆抗体通过中和CXCR4 基因，可以增强化疗药物的敏感度，LPS 易于获得，价格相对便宜，是否具有此功能，目前尚无研究。本研究应用LPS 与5 -FU 共同作用于QBC939 细胞后，通过MTT 法及流式细胞法来观察胆管癌细胞成活率及凋亡率的变化，观察LPS 对化疗的影响。

材料与方法

1.材料:人永生化胆管癌细胞系QBC939，由第三军医大学西南医院肝胆外科中心王曙光等建株。胰蛋白酶:购自湘雅医学院细胞中心。新生小牛血清购自天津灏洋生物工程有限公司。溴化二甲基噻唑二苯四氮唑(MTT)购自美国AMRESLO 公司。二甲基亚砜(DMSO)购自北京鼎国生物工程有限公司。

2.试验方法:(1)细胞培养:人胆管癌细胞株QBC939，用含10% 小牛血清的RPMI 1640 培养液，于37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养，0.25%的胰蛋白酶消化传代。(2)试验分组:取对数生长的QBC939 细胞，分为对照组及试验组，对照组加等量培养液，试验组分为两组，试验1 组加5 -FU(浓度为1μg/ml)，试验2 组加5 -FU +LPS，5 -FU 浓度相同，LPS剂量采用1μg/ml。观察QBC939 细胞生长状况良好，加到96孔板内，每孔细胞数1 ×104，按组加入药物，每孔总体积为0.2ml，每孔设3 个复孔，共接种7 板。(3)MTT 比色法绘制细胞生长曲线:每日取出1 板，弃去培养液，生理盐水漂洗1 遍，每孔加入20μl 的MTT，浓度为5mg/ml;继续培养4h，倾尽上清;每孔加入二甲基亚砜0.1ml 摇床上摇动约15min 以充分溶解;用酶标仪在波长540nm 处检测各孔光密度值(A 值)。然后以A 值为纵坐标时间(天)为横坐标绘制细胞生长曲线。(4)流式细胞仪检测细胞凋亡:调整细胞浓度至1 ×(105～106)ml，3 组细胞常规条件下培养72h 后，1000r/min 离心5min PBS 洗涤，重复3 次，70%乙醇固定后上机。采用Beckon/Dickinson Facssort 型流式细胞仪，在488nm 波长处进行检测，测量的数据和图片送入计算机，应用相应程序软件进行资料的处理和分析。

3.统计学方法:使用SPSS 13.0 统计软件包处理数据。数据以均数±标准差(±s)表示。各组间比较应用t 检验及单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.MTT 检测LPS 对5 -FU 化疗效果的影响:从各组细胞的生长曲线可以看出，对照组细胞移植处于增殖中，试验1 组(5 -FU 组)和2 组(5 -FU +LPS组)生长趋势一致，前2 天A540 值均明显下降，但自第3 天开始，试验1 组A540 值停止下降，第4 天A540 值出现缓慢上升，而试验2 组却持续下降，至第7 天，两组细胞的A540 值出现统计学差异(P ＜0.05)，提示5 -FU 对胆管癌细胞株QBC939 杀伤作用明显，但易出现耐药性，而加用LPS 后，能一定程度上防止耐药的出现(图1，表1)。

图1 各组1 周生长曲线图

2.流式细胞仪检测LPS 对5 -FU 诱导QBC939细胞凋亡的影响:化疗药物5 - FU 能显著诱导QBC939 细胞发生凋亡，未加药前凋亡指数为3.53 ±0.32，而加化疗药物5 -FU 后，凋亡指数为11.5 ±2.15，两者比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)，同时合用LPS 后，能更明显的诱导凋亡，凋亡指数达到26.5 ±3.12，与单用加化疗药物5 -FU 比较，差异有统计学意义(P ＜0.05，表2)。

表1 第7 天两试验组OD 值比较

表2 LPS 对5 -FU 诱导QBC939 细胞凋亡的影响

讨 论

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是化疗失败的主要原因。其耐药机制有多种解释，主要是多药耐药(multidrug resistance，MDR)，包括P -糖蛋白和多药耐药相关蛋白等，肿瘤细胞凋亡机制的缺陷也是MDR 其中的机制之一，不同肿瘤细胞对化疗敏感度的差异，主要是各种肿瘤细胞对凋亡的阈值不同。对细胞凋亡机制的修复可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感度，克服耐药性的产生，因此诱导肿瘤细胞的凋亡和增强化疗药物的敏感度成为近年来肿瘤治疗的重要策略。

本试验结果表明，5 -FU 对胆管癌杀伤作用明显，但3 天后即出现明显的耐药。有研究显示，单用LPS 对胆管癌细胞株QBC939 的增殖有抑制作用，但没有杀伤作用:1.0μg/ml 浓度的LPS 与细胞共培养72h，OD 值为0.329 ±0.108，较对照组细胞0.552 ±0.142 的OD 值低，但较同浓度LPS 与细胞共培养24h 时的OD 值0.229 ±0.074 增高，说明细胞有增殖，而LPS 与5 -FU 合用对胆管癌细胞株QBC939 的杀伤作用明显而且持续，从MTT 法绘制出的生长曲线可以看出，合用LPS 虽然不能加强早期5 -FU 对胆管癌细胞株QBC939 的杀伤效应，但可以有效防止耐药性的产生，1 周后，合用LPS 杀伤作用明显强于不用者，单用5 -FU 组 的OD 值为0.125 ±0.013，5 -FU+LPS组的OD 值为0.059 ±0.011，差异有统计学意义［2］。结合流式细胞结果看，LPS 有效的防止5 -FU 对胆管癌细胞株QBC939 耐药性的产生可能与LPS 能更明显的诱导细胞凋亡有关。SDF-1/CXCR4 基因在很多肿瘤中有表达，而对白血病的研究表明，抑制白血病细胞表面的CXCR4 基因表达，也能很好的增强化疗药物对白血病细胞后期的杀伤作用，本试验结果与此一致［3～6］。说明CXCR4 基因的过表达可能是肿瘤细胞耐药的重要机制。而应用LPS 后，能明显的诱导肿瘤细胞凋亡，并增强化疗药物5 -FU对胆管癌细胞株QBC939 的后期杀伤作用，在胆管癌的治疗中，LPS 能发挥积极作用。

趋化因子及其受体是近年肿瘤研究的热点，CXCR4 基因及其配体SDF -1 在多种肿瘤的生长与转移中发挥重要作用［4］。虽然其机制尚未完全清楚，但针对这一基因组的抗肿瘤治疗已经在一些试验研究中得到证实，本试验表明，LPS 不仅能抑制胆管癌细胞株QBC939 的增殖与侵袭能力，也能很明显的增强化疗药物的作用。

1 霍胜军，汤恢焕，魏伟. CXCL12 及受体CXCR4 在胆管癌中的表达及其临床意义［J］.现代生物医学进展，2008，8(4):658 -660

2 霍胜军，汤恢焕，曾祥福. CXCR4 抑制剂LPS 对胆管癌细胞株QBC939 生物学行为的影响［J］. 中国肿瘤临床，2010，37(12):669 -672

3 章大谦，吴广胜.急性白血病患者血清、脑脊液趋化因子SDF-1 测定及意义［J］.现代生物医学进展，2010，10(3):658 -660

4 徐斌，韩绍伟，周笑珍，等. CXCR4 和MMP -9 在胃癌组织中的表达及其与淋巴转移的关系［J］.医学研究杂志，2012，41(4):112 -115

5 李利义，罗越，郑志强，等.CXCR4 和VEGF 在胃癌中的表达及临床病理因素的关系［J］.医学研究杂志，2011，40(10):85 -88

6 王莹，李文缘，梁金花，等. SDF - 1/CXCR4 的表达与喉癌组织VEGF-C 表达的淋巴管生成及预后的相关性［J］.医学研究杂志，2012，41(8):50 -54