牡荆素人工抗原的合成与免疫原性的鉴定

冯盛岚， 屈会化， 贺娜娜， 赵灵灵， 任雅君， 成金俊， 赵 琰， 王庆国

（1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.北京中医药大学 “经典方剂的应用基础研究”创新团队，北京100029；3.北京中医药大学科研实验中心，北京100029；4.北京中医药大学基础医学院，北京100029）

牡荆素人工抗原的合成与免疫原性的鉴定

冯盛岚1，2， 屈会化2，3#， 贺娜娜1，2， 赵灵灵1，2， 任雅君1，2， 成金俊1，2， 赵 琰2，4*， 王庆国2，4*

（1.北京中医药大学中药学院，北京100102；2.北京中医药大学 “经典方剂的应用基础研究”创新团队，北京100029；3.北京中医药大学科研实验中心，北京100029；4.北京中医药大学基础医学院，北京100029）

目的合成牡荆素的人工抗原，并对其免疫原性进行了鉴定。方法利用高碘酸钠氧化法偶联牡荆素制备牡荆素-牛血清白蛋白的免疫抗原和牡荆素-卵清蛋白的包被原；用紫外分光光度法和薄层色谱法鉴定小分子与载体蛋白偶联反应，并用间接ELISA测定免疫抗原免疫小鼠抗体效价，间接竞争ELISA（ic-ELISA）检测抗体特异性。结果紫外扫描和薄层色谱结果表明牡荆素与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联成功，小鼠经牡荆素-牛血清白蛋白免疫后，体内产生了抗牡荆素抗体，效价在1：16 000以上，线性检测范围为0.028 8～18μg/mL。结论合成的牡荆素人工抗原和专属酶联免疫分析法可用于后续的单克隆抗体的制备。

牡荆素；牛血清白蛋白；卵清蛋白；抗牡荆素抗体；高碘酸钠法；免疫分析法

牡荆素（vitexin，VXn）是山楂叶、淡竹叶等植物的主要活性成分之一［1-2］，属于黄酮碳苷类天然产物，还以其他苷类形式广泛存在于许多中草药中，并成为其有效成分。牡荆素具有降压、降脂、抗氧化、抗肿瘤、抗感染、保护心血管、舒张气管平滑肌等多种药理活性［3-9］，是益心酮片、复方丹参降脂颗粒、咳特灵胶囊等中成药的有效成分［10-12］，有较高的药用价值及经济价值。

目前，牡荆素的定性检测与定量测定的分析方法有高效液相色谱法 （HPLC）、液质联用法（HPLC-MS）、毛细管电泳法等［10，13-14］，其中以HPLC法最为常用。但中药活性成分众多，而且含牡荆素的某些生物样品含有大量的影响成分定量测定的蛋白质及内源性物质，处理程序繁复，操作耗时费力。近年来，小分子单克隆抗体技术发展迅速，以该技术为依托的中药活性成分免疫分析方法具有高灵敏度、高通量、强特异性、前处理简单以及不依赖贵重仪器等特点，在中药成分分析中具有独特的优势，引起了国内外广泛关注［15-16］。为了建立牡荆素免疫分析方法，本研究首先合成了牡荆素的人工抗原，并对其免疫原性进行了鉴定。

1 材料及仪器

1.1 动物 SPF级Balb/c小鼠4只，6～8周龄，雌性，维通利华实验动物中心提供，许可证号SCXK（京）2012-0001。

1.2 试剂 牡荆素，成都普菲德生物技术有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA），北京欣经科生物技术有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），美国 Sigma公司；高碘酸钠（NaIO4），分析纯，国药集团北京化学试剂公司；弗氏完全佐剂 （F5881），美国Sigma公司；弗氏不完全佐剂 （F5506），美国Sigma公司；酶标二抗（HRP-标记羊抗鼠IgG），美国Gene-Script公司；四甲基联苯胺（TMB），美国Sigma公司；碳酸盐缓冲液（CBS，pH 9.6，0.05 mmol/L，自制）；磷酸盐缓冲液 （PBS，pH 7.4，自制）；洗涤缓冲液（PBST，pH 7.4，自制）；底物缓冲液 （磷酸柠檬酸，pH 5.0，自制）；终止液（2 mmol/L H2SO4，自制）。

1.3 仪器 BS124S电子分析天平 （德国赛多利斯公司）；84-1A磁力搅拌器 （上海司乐仪器有限公司）；可调微量加样器 （德国Eppendorf公司）；14000截留透析袋 （美国Sigma公司）；Beckman coulter DU 800紫外-可见分光光度计（美国Beckman公司）；TGL-16G台式高速冷冻离心机（北京医用离心机厂）；96孔酶标板 （美国Corning公司）；Tecan Safire 2全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；Millipore纯水系统（美国Millipore公司）。

2 方法

2.1 牡荆素人工抗原的合成 以本实验室以往经验为参考［17-19］，采用高碘酸钠法，将牡荆素与卵清蛋白偶联成包被原，与牛血清白蛋白偶联成人工免疫原。具体方法如下：准确称量4.8 mg牡荆素置于棕色西林瓶中，用4 mL DMF使其完全溶解。NaIO45.0 mg充分溶于1 mL蒸馏水中，将后者逐滴加入前者中，加好后密封，锡箔纸包裹避光，室温下磁力搅拌反应1.5 h，得牡荆素氧化产物，称为A液。准确称量牛血清白蛋白/卵清蛋白各3.6 mg，分别充分溶于2 m L CBS中，称为B液。然后将A液逐滴加入B液中，滴加完毕后，用1 mol/L Na2CO3调pH至9.0以上，在封闭的条件下室温下搅拌过夜。待上述反应完成后，将其转移至透析袋中，透析袋先用蒸馏水预处理，混合液在搅拌条件下用蒸馏水透析72 h，中间多次换液至透析袋外部液体中无法测出牡荆素。透析后的产物分装，于-20℃保存待用。

2.2 牡荆素人工抗原的鉴定

2.2.1 紫外分光光度法 用蒸馏水配制合适浓度的牛血清白蛋白、卵清蛋白与牡荆素标准溶液，将待测样品用蒸馏水稀释到合适浓度，使它们在紫外分光光度计全波长扫描中能呈现完整的图像［20］，测出牡荆素-牛血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、牡荆素-牛血清白蛋白、牡荆素-卵清蛋白的紫外全波长图谱。

2.2.2 薄层色谱法 将已透析过的待测样品牡荆素-牛血清白蛋白和牡荆素-卵清蛋白用蒸馏水稀释到合适浓度，用蒸馏水配制合适浓度的牡荆素、牛血清白蛋白、卵清蛋白标准溶液。将待测样品和标准溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，用三氯甲烷-甲醇 （4：1）为展开剂，3次展开后晾干，于254 nm紫外波长下观察。

2.2.3 动物免疫 雌性Balb/c小鼠编号1～4号，用牡荆素-牛血清白蛋白免疫1～3号小鼠，免疫方式为背部皮下多点注射免疫，剩余的4号小鼠作为阴性对照。首次免疫用等体积的弗式完全佐剂充分乳化，剂量以免疫原计约为60μg/只，以后隔1周左右加强免疫1次，加强免疫改用弗式不完全佐剂乳化抗原，免疫剂量不作改变。第3次加强免疫开始后7 d断尾取血。血液样品4℃下5 000 r/min离心10 min，取血清，分别编号为1#、2#、3#、4#。

2.2.4 ELISA法测定血清中的抗体效价 以牡荆素-卵清蛋白为包被原，用CBS稀释1 000倍，100 μL/孔加入96孔酶标板中，37℃孵育1 h。PBST洗板3次，每次5 min，拍干。用10 mg/mL明胶封闭，每孔200μL，37℃孵育1 h。洗板，操作同上。将1～3号小鼠的抗血清稀释1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000倍，分别将稀释好的血清以100μL/孔的量加入孔中。以4号小鼠的血清作为阴性对照，37℃孵育1 h，洗板。PBS稀释HRP-羊抗鼠二抗10 000倍，每孔加入100μL，37℃孵育0.5 h，洗板5次，拍干。每孔加入显色液100μL，37℃孵育显色，15 min后每孔50μL终止液终止反应，终止液为2 mmol/L硫酸，测定OD450nm吸光度。以同一稀释倍数下抗血清 （P）与阴性血清 （N）OD450nm比值（P/N）大于2.1时血清的最大稀释度定为抗体效价。

2.2.5 ic-ELISA法测定血清中的抗体特异性 以牡荆素-卵清蛋白作为包被原，用CBS稀释1 000倍，100μL/孔加入96孔酶标板中，37℃孵育1 h。以PBST洗板3次，每次5 min，拍干。用10 mg/mL明胶封闭，每孔加200μL，37℃孵育1 h。洗板，操作同上。抗血清稀释倍数为1 000，牡荆素分 别 稀 释 为 90、18、3.6、0.72、0.144、0.028 8μg/mL和对照值0μg/mL，每孔先加入小分子50μL，再加入抗血清50μL。37℃孵育1 h，洗板3次。每孔加入100μL HRP-羊抗鼠二抗，二抗用PBS稀释10 000倍，37℃孵育0.5 h，洗板5次。每孔加入显色液100μL，37℃孵育显色15 min后每孔加2 mmol/L硫酸50μL终止反应，测定OD450nm吸光度。

3 结果

3.1 牡荆素-牛血清白蛋白，牡荆素-卵清蛋白的紫外分光光度鉴定 牡荆素、牛血清白蛋白、牡荆素-牛血清白蛋白的紫外分光光度结果如图1所示。牡荆素在268 nm处有吸收峰，牛血清白蛋白紫外特征吸收峰为278 nm，而牡荆素-牛血清白蛋白在190 nm到300 nm的紫外吸收与牡荆素、牛血清白蛋白在此段波长的紫外吸收不相同，展示出了与牡荆素、牛血清白蛋白不同的特性，说明有新的物质生成。牡荆素-卵清蛋白的紫外图谱同样显示出了与牡荆素和牛血清白蛋白不同的特性 （见图2），因此可以判断牡荆素与牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联成功。

图1 牡荆素-牛血清白蛋白紫外扫描图Fig.1 Full-w ave ultraviolet spectrogram of vitexin-BSA

图2 牡荆素-卵清蛋白紫外扫描图Fig.2 Full-wave ultraviolet spectrogram of vitexin-OVA

3.2 牡荆素-牛血清白蛋白，牡荆素-卵清蛋白的薄层色谱图 薄层色谱是鉴定人工抗原是否合成成功的简便方法［21］。牡荆素、牛血清白蛋白、牡荆素-牛血清白蛋白薄层结果如图3，牡荆素、卵清蛋白、牡荆素-卵清蛋白薄层结果如图4，牡荆素-牛血清白蛋白在展开剂条件下能够展开并在254 nm紫外灯下呈黑色斑点，牛血清白蛋白、卵清蛋白是蛋白质大分子，在此条件下不会展开，也不会显色，而牡荆素-牛血清白蛋白，牡荆素-卵清蛋白未展开，但二者却在点样原点显示黑色斑点，说明了二者同时具有载体蛋白与牡荆素的特点，上述结果说明牡荆素与牛血清白蛋白和卵清蛋白偶联成功。

3.3 ELISA法测定血清中的抗体效价结果 经过5次免疫后，小鼠产生抗牡荆素抗体，以P/N值≥2.1时的稀释倍数为血清的效价，则小鼠血清效价均在1：16 000以上。结果如图5所示。

图3 牡荆素，牡荆素-牛血清白蛋白，牛血清白蛋白薄层Fig.3 TLC ch romatogram of vitexin，vitexin-BSA and BSA

图4 牡荆素，牡荆素-卵清蛋白，卵清蛋白薄层Fig.4 TLC chromatogram of vitexin，vitexin-OVA and OVA

图5 ELISA法测定抗牡荆素抗体的效价Fig.5 Serum tilter of vitexin-BSA immunised m ice 1-3

3.4 ic-ELISA法测定血清中的抗牡荆素抗体特异性 检测结果表明，牡荆素对3只小鼠的免疫血清均有竞争抑制，这说明小鼠血清中产生的抗体对牡荆素具有特异性。以牡荆素质量浓度为0对应的孔OD450值为A0，以其他各种质量浓度牡荆素对应的孔OD450值为A，计算出小鼠抗血清间接接竞争抑制曲线的线性方程和r2，结果见表1。其中竞争最好的是3号小鼠，其抗血清的竞争抑制曲线斜率是-0.084，相关系数可达0.998 1。

表1 牡荆素-牛血清白蛋白免疫小鼠抗血清的间接竞争试验结果Tab.1 Linear equation of ic-ELISA

4 讨论

基于中药小分子抗体的免疫分析方法不受中药活性成分众多、样品前处理复杂等问题的困扰，它不仅具有耗时少、高通量、高灵敏度、高准确度、受内源性物质影响小等优点，而且有酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、免疫芯片法等多种技术形式，因此，它在中医药领域具有广阔的应用前景［17，22］。合成牡荆素人工抗原，产生抗牡荆素抗体，进而建立相应的免疫分析方法，我们可将其应用于含牡荆素的中药饮片和中成药等的分析检测和质量控制，以及进行相关药物作用机理和药代动力学的深入研究。

牡荆素人工抗原的合成参考了本实验室以往经验［19，23-24］，采用高碘酸钠氧化法。高碘酸钠法操作简便，合成条件温和，其原理为高碘酸钠氧将糖基侧链中的邻羟基氧化为双醛基，双醛基再与载体蛋白的氨基相偶联形成人工抗原及包被原。高碘酸钠能保留牡荆素的特征性结构，为下一步制备特异性高的牡荆素单克隆抗体奠定基础。人工抗原合成除了适用于糖基的高碘酸钠氧化法外，还有适用于羧基的混合酸酐法和碳二亚胺法等。选择半抗原的连接基团不同，偶联方法的选用、半抗原表位构型的表达也随之产生差异。这种差异不仅影响半抗原的免疫原性，更决定了其免疫抗体的特异性［25］，故应慎重选择。

目前，鉴别人工抗原合成成功与否的方法有多种，如质谱法、电泳法、同位素示踪法、紫外分光光度法等［26］。本研究采用较为便捷的薄层色谱法和紫外光谱法对合成产物进行初步鉴定。薄层色谱法简便易行，所需样品量小，适用范围广而成本低，可以极大地推动人工抗原合成条件优化的进程［27］。紫外分光光度法是一种成熟并易于普及的方法，操作简单易于掌握，结果直观便于分析，适用于人工抗原的初步鉴定。初步鉴定后，再通过间接ELISA和间接竞争ELISA对其免疫原性进行鉴定。经过鉴定，牡荆素与载体蛋白 （牛血清白蛋白/卵清蛋白）成功偶联，所合成的牡荆素-牛血清白蛋白可以使小鼠体内产生抗牡荆素抗体，效价在1：16 000以上；且产生抗体具有牡荆素特异性。这些结果也进一步证明了牡荆素人工抗原合成成功。

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Synthesis and identification of artificial antigens of vitexin

FENG Sheng-lan1，2， QU Hui-hua2，3#， HE Na-na1，2， ZHAO Ling-ling1，2， REN Ya-jun1，2， CHENG Jin-jun1，2， ZHAO Yan2，4*， WANG Qing-guo2，4*

（1.School of TCM，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2.Innovation Team of“Classical Prescriptions of Applied Basic Research”，Beijing 100029，China；3.Scientific Research and Experiment Center of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；4. School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

AIMTo synthesize the artificial antigen ofvitexin and identify its immunogenicity.METHODSCarrier protein was employed to couple vitexin to form immunogenic antigen（vitexin-BSA）and coating antigen（vitexin-ovalbumin）via sodium iodide oxidation method.UV spectrometry and thin layer chromatography（TLC）method was used in the characterization of the synthesis.Balb/c mice were immunized with the prepared vitexin-BSA immunogenic antigen.Their tilter and specificity of the anti-serum was examined and detected by indirect ELISA and indirect competitive ELISA（ic-ELISA），respectively.RESULTSUV spectrometry and TLC conformed that vitexin conjugated with ovalbumin and BSA were carried out.Receiving vitexin-BSA，the mice produced anti-vitexin antibodies specifically，whose titer was above 1：16 000，and their linear range detection was from 0.028 8μg/mL to 18μg/mL.CONCLUSIONThe synthesized artificial antigen of vitexin and special ELISA can be applied to the preparation ofmonoclonal antibodies.

vitexin；bovine serum albumin（BSA）；ovalbumin；anti-vitexin antibodies；sodium periodate oxidation；immunoassaymethod

R284.3

A

1001-1528（2015）04-0805-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.024

2014-10-08

国家自然科学基金 （81373542，81274043）

冯盛岚 （1991—），女，硕士，研究方向为中药免疫分析技术。

#共同第一作者：屈会化 （1966—），男，博士，副研究员，硕士生导师，研究方向为中药免疫分析技术。Tel：（010）64286705，E-mail：quhuihua@gmail.com

*通信作者：赵 琰 （1973—），女，博士，研究员，博士生导师，研究方向为经典方剂的现代应用。Tel：（010）64286705，E-mail：zhaoyandr@gmail.com