青防肿痛外敷散对膝关节骨性关节炎模型家兔的影响

郭玉岩， 吕邵娃， 王 锐， 孙 爽， 孟令超， 李永吉

（黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

青防肿痛外敷散对膝关节骨性关节炎模型家兔的影响

郭玉岩， 吕邵娃， 王 锐， 孙 爽， 孟令超， 李永吉*

（黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

目的探讨青防肿痛外敷散抗炎及对膝关节骨性关节炎家兔的治疗作用。方法采用大鼠足肿胀法和棉球肉芽肿试验，观察其抗炎作用。关节制动法制备家兔膝关节骨性关节炎模型，采用青防肿痛外敷散高、中、低剂量及阳性对照组进行干预，观察给药前后家兔关节形态、血清中超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛 （MDA）的变化及其关节病理改变情况。结果青防肿痛外敷散高、中、低剂量组对大鼠足肿胀度4 h达到最大抑制，有效降低棉球肉芽肿。正、侧位CR片显示青防肿痛外敷散有效改善关节软骨形态，血清中SOD和MDA变化具有统计学意义 （P＜0.05），可明显改善家兔膝关节的病理变化。结论青防肿痛外敷散有抗炎作用；可改善膝关节软骨宏观和微观形态，对膝关节骨性关节炎有治疗作用。

青防肿痛外敷散；膝关节骨性关节炎；药效学

青风藤为防己科植物青藤或毛青藤等的干燥藤茎，始载于宋代 《图经本草》［1-3］，具有祛风湿、通经络、利水止痛等功效，中医用其治疗风湿性疾病已有1千多年的历史［4-5］；防己为防己科多年生木质藤本植物粉防己的干燥根，也具有祛风湿、止痛、利水消肿的功效［6］，经典方剂常将二者相须为用，治疗风湿痹痛。课题组以青风藤和防己为主药，经提取精制后，加适宜辅料制备而成的青防肿痛外敷散，具有祛风除湿、消肿止痛之功效，用于膝关节骨关节炎等风湿痹阻症治疗。本实验在前期研究工作基础上对青防肿痛外敷散进行了抗炎作用研究，并建立特异性动物模型［7-9］，考察其对膝关节骨性关节炎的影响。

1 材料

1.1 仪器与试剂 Digita1 Diagnost直接数字化成像系统（飞利浦公司）；FJ-2003PS放射免疫计数仪 （西安二六二厂）；FA2004分析电子天平 （上海良平仪器仪表有限公司）。

TGL—16C台式离心机 （上海安亭科学仪器厂）；人超氧化物歧化酶 （SOD）ELISA试剂盒 （上海信裕生物科技有限公司）；人丙二醛 （MDA）ELISA试剂盒 （上海远慕生物科技有限公司）；角叉菜胶 （Sigma公司）。

1.2 药品 青防肿痛外敷散（QF-WFS，哈尔滨怡康药业有限公司，20130402）；芎芷痛瘀散 （河北神达药业有限公司，130205）。

1.3 动物 Wistar大鼠，雌雄各半，体质量150～200 g，清洁级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，生产许可证为SCXK黑2008004。

新西兰大白兔，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，由吉林大学实验动物中心提供，许可证号 SCXK（吉）2008-0004。

2 方法

2.1 实验动物分组及给药

2.1.1 大鼠抗炎试验 棉球肉芽肿试验，W istar大鼠分5组，每组10只。各组分别为：芎芷痛瘀散组 （0.720 g/kg）、青防肿痛外敷散高剂量组 （2.430 g/kg）、青防肿痛外敷散中剂量组 （1.215 g/kg）、青防肿痛外敷散低剂量组 （0.405 g/kg）和对照组 （无刺激性胶布）。角叉菜胶致足肿胀试验分5组，各组与棉球肉芽肿试验相同，另增加模型组。各给药组试验贴敷给药，每日一次。

2.1.2 家兔膝关节骨性关节炎试验 新西兰家兔随机分为6组，每组8只。按动物与人体折算系数表折算，采用按体质量与按给药面积相结合的方法设计给药量，分别为芎芷痛瘀散组（0.373 g/kg，9.30 cm2/只）、青防肿痛外敷散高剂量组（1.260 g/kg，28.05 cm2/只）、青防肿痛外敷散中剂量组（0.630 g/kg，14.00 cm2/只）、青防肿痛外敷散低剂量组（0.210 g/kg，4.67 cm2/只）、模型组及对照组。将各给药组家兔膝关节周围剃毛，涂少量水后，将药物贴敷于关节处，用保鲜膜包裹，青防肿痛外敷散高、中、低剂量组每天换一次药。芎芷痛瘀散组每5天换一次药。

2.2 大鼠足肿胀模型 分组与给药同 “2.1.1”项。末次给药前，采用排体积法先测量每鼠正常足跖容积，连续给药4 d，于末次给药0.5 h后，将大鼠左后足底皮下注射1%角叉菜胶 （0.1 mL/只），致炎后分别在0.5、1、2、4和6 h测定其足跖容积，以观察足跖肿胀程度。

2.3 棉球肉芽肿模型 分组与给药同 “2.1.1”项。取各组大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，在左前肢腋下切开小口，用眼科镊将已经称定约为20 mg的灭菌棉球从切口植

2.4 家兔膝关节骨性关节炎模型 分组与给药同 “2.1.2”项，将实验家兔左膝于腹股沟以下1.5 cm至踝关节下3 cm（趾端），伸直位石膏固定，关节制动2周后各给药组开始给药。给药前需将各给药组家兔膝关节周围剃毛，涂少量水后，将药物贴敷于关节处，用保鲜膜包裹，再用管型石膏继续固定4周。给药期间观察各实验动物活动情况。制动6周后，10%水合氯醛耳缘静脉注射将家兔麻醉，进行X线片拍摄，观察有无骨赘增生、关节间隙变窄、关节软骨下骨硬化及有无关节变形；取后肢隐静脉血，离心后取血清，采用酶联免疫法 （ELISA）检测SOD和MDA的值［10-11］；动物处死，切开造模膝关节，大体观察膝关节软骨、软骨下骨及滑膜情况；取膝关节标本HE染色，光镜下观察。

3 结果

3.1 大鼠足肿胀试验 结果见表1。青防肿痛外敷散各给药组同模型组相比，均能抑制大鼠足肿胀，而且呈现一定的量效关系，表明青防肿痛外敷散具有明显的抑制角叉菜胶所致的大鼠足肿胀的作用。

表1 青防肿痛外敷散对大鼠足肿胀的影响 （，n=10）

表1 青防肿痛外敷散对大鼠足肿胀的影响 （，n=10）

注：各组均与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量/（g·kg-1）致炎后足肿胀度/% 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h青防肿痛外敷散组 2.430 15.8±5.1* 23.0±4.8** 28.3±4.5** 19.6±5.2** 15.3±4.8**青防肿痛外敷散组 1.215 16.5±6.0* 23.7±5.8* 29.7±7.2** 24.0±7.1** 17.8±5.0**青防肿痛外敷散组 0.405 17.0±4.6* 24.2±5.5* 31.0±7.4** 26.3±7.2** 20.7±5.9**芎芷痛瘀散组 0.720 16.3±6.2* 22.7±5.7** 28.5±6.3** 23.8±6.1** 19.1±5.0**模型组 —22.8±7.4 33.4±9.8 43.5±7.3 37.5±6.9 31.8±7.5

3.2 棉球肉芽肿试验 结果见表2。青防肿痛外敷散高、中、低剂量组试验结果均小于对照组，具有统计学意义，说明青防肿痛外敷散能够抑制肉芽的生长，对由棉球刺激引起的炎症具有治疗作用。

表2 青防肿痛外敷散对棉球肉芽肿的影响（，n=10）

表2 青防肿痛外敷散对棉球肉芽肿的影响（，n=10）

注：各组均与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量/（g·kg-1）肉芽干质量/mg 抑制率/%青防肿痛外敷散组 2.430 20.5±7.1**52.7青防肿痛外敷散组 1.215 25.0±8.6** 42.4青防肿痛外敷散组 0.405 28.0±6.0** 35.4芎芷痛瘀散组 0.720 23.3±5.7** 46.3模型组- 43.4±10.0 -

3.3 家兔膝关节骨性关节炎模型试验

3.3.1 家兔膝关节骨性关节炎模型建立的评价 关节制动法造模6周后，实验家兔出现关节僵直、跛足的情况，影像学观察，模型组家兔骨关节都有不同程度的退变，关节间隙变窄、关节软骨下骨硬化及关节变形和有骨赘增生，表明家兔膝关节骨性关节炎模型造模成功。

3.3.2 血清中SOD和MDA的变化 结果见表3。由表结果可知，空白组的SOD水平高于模型组，MDA水平低于模型，具有统计学意义，说明该模型会降低家兔血清中SOD浓度，升高血清中MDA浓度，破坏免疫系统的正常功能。青防肿痛外敷散高、中剂量组SOD水平高于模型组、MDA水平低于模型组，均具有统计学意义，说明，青防肿痛外敷散能够提高模型家兔的免疫能力，增强免疫系统的功能。

表3 青防肿痛外敷散组对血清中MDA、SOD的影响（，n=8）

表3 青防肿痛外敷散组对血清中MDA、SOD的影响（，n=8）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.01

组别 剂量/（g·kg-1，cm2/只） SOD/（μmo1·mL-1） MDA/（nmo1·mL-1）空白组 —312.69±22.17 2.51±0.74模型组 — 225.16±24.31a 3.87±0.45a青防肿痛外敷散组 1.260，28.05 307.59±20.26b 2.59±0.40b青防肿痛外敷散组 0.630，14.00 282.90±29.74a、b 2.91±0.53b青防肿痛外敷散组 0.210，4.67 260.50±18.76a 3.20±0.60芎芷痛瘀散组 0.373，9.30 283.85±37.01b3.23±0.65

3.4 膝关节影像学观察结果 结果见图1。由图1结果可知，模型组家兔膝关节关节间隙发生变化，外侧间隙增大，内侧间隙明显狭窄，关节失稳；关节面硬化、不光整、粗糙变形，关节边缘有明显骨赘；青防肿痛外敷散低剂量组关节内侧间隙变窄，外侧间隙稍宽，关节边缘有骨赘形成，关节面粗糙变形、有轻微的硬化；青防肿痛外敷散高剂量组实验动物关节内侧间隙稍变窄，关节面轻微硬化，与模型组比较关节面尚光整，未见明显骨赘形成；青防肿痛外敷散中剂量组动物表现介于受试物高、低剂量组之间，与模型组动物比较有明显改善。

图1 青防肿痛外敷散对膝关节影像学影响结果图

3.5 膝关节光镜观察结果 结果见图2。由图2结果可见模型组膝关节软骨表面出现裂隙，软骨缺损区，软骨变薄，表浅层细胞消失，移形层细胞部分消失，存在软骨细胞簇聚现象，放射层细胞簇聚现象，核萎缩，潮标线不完整。裂隙周围可见脱水固缩坏死的软骨细胞，靠近表层有较多囊性改变，软骨细胞排列紊乱，4层结构不易分辫。青防肿痛外敷散低剂量组膝关节软骨变薄，软骨有裂隙，有较小软骨缺损区，表浅层缺失，细胞大部分消失，移形层与放射层软骨细胞簇聚现象，潮标线稍不完整，可见软骨细胞增生。青防肿痛外敷散中剂量组膝关节软骨膜光滑，表面无裂隙，无溃烂，细胞数量一般，细胞形态类圆形。细胞排列欠规则，潮线尚完整。青防肿痛外敷散高剂量组实验动物软骨膜光滑，表面无裂隙、无溃烂，软骨细胞数量较多，形态较圆而大，排列正常，但细胞核略长，潮标线尚完整。

图2 青防肿痛外敷散对膝关节病理影响组织切片图

4 讨论

局部炎症细胞的浸润及其炎性细胞因子的大量产生是引起炎症反应的重要因素，炎性因子不仅是炎症细胞的产物，而且反过来影响炎症细胞，引起级联反应，加重病情。青防肿痛外敷散对大鼠足肿胀和棉球肉芽肿均显示较强的抑制作用，其原因可能为主要有效成分青藤碱能够抑制前列腺素 （PGE2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症介质的产生，起到抗炎的作用，其确切的作用靶点有待进一步深入研究。

家兔膝关节骨性关节炎模型得制备有多种方法，包括手术法、固定法以及关节腔注射法，其中最常用的为手术法［12］。但由于本实验试药为外敷用散剂，在手术法造模部位进行给药极易引起实验动物感染，因此，在成功预实验基础上，本文采用固定法制备膝关节骨性关节炎模型。模型建立中影像学观察兔膝关节外侧间隙增大，内侧间隙明显狭窄，关节失稳，关节边缘有明显骨赘形成，说明造模成功。

MDA和SOD是反应氧自由基的水平和氧自由基清除能力的主要指标，SOD活力大小可反应机体清除氧自由基的能力，MDA水平可反应氧自由基水平的变化［13-14］。膝关节骨性关节炎实验时模型动物血清中SOD活力降低，MDA水平升高，表明SOD和MDA与膝关节炎病变的程度呈负相关。青防肿痛外敷散高、中剂量可有效提高血清中SOD活力和降低MDA水平，分析其作用机制可能为通过提高SOD的活力来清除机体多余自由基，抑制氧自由基对软骨细胞的损害，从而达到保护软骨及其基质免受氧自由基侵害的作用，进而延缓关节软骨的退变，发挥治疗膝骨关节炎的作用。

［1］（北宋）苏 颂.本草图经［M］.福州：福建科技出版社，1982：678.

［2］（明）李时珍.本草纲目［M］.长春：吉林大学出版社，1982：1340.

［3］（明）倪朱谟.本草汇言［M］.北京：中医古籍出版社，2005：297.

［4］郑春松，徐筱杰，叶蕻芝，等.青风藤治疗骨性关节炎药效物质基础多靶导向作用的计算机模拟研究［J］.中国中西医结合杂志，2012，32（3）：375-379.

［5］梁瑞燕，曹柳英，王文君，等.青藤碱抗炎作用机理研究［J］.广州中医药大学学报，2007，24（2）：141-143.

［6］张晶蓉，武重阳.防己的临床药效及应用［J］.吉林医药学院学报，2006，27（4）：235-2376.

［7］杨瑞甫，胡蕴玉，吴银松，等，兔骨关节炎两种动物模型的比较［J］.中国矫形外科杂志，2006，14（19）：1497-1499.

［8］胡 波，胡志俊，张有为，等.骨关节炎动物模型：人工诱导与动物自发［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（33）：6202-6205.

［9］翟吉良，翁习生，邱贵兴.骨关节炎动物模型的建立及选择［J］.中国矫形外科杂志，2007，15（11）：843-845.

［10］武玉锦，方建国，刘绍明.健膝汤对兔膝骨性关节炎模型血清和关节液中自由基水平的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2010，18（1）：15-16.

［11］孙嘉利，范建中，兔膝关节骨性关节炎的模型制作及组织病理学［J］.中国康复，2005，20（2）：78-80.

［12］马志刚，孙玉明，谢 林.骨性关节炎人工造模的国内外研究新进展［J］.湖北中医药大学学报，2011，13（1）：64-67.

［13］徐 谊.鹿瓜多肽注射液对膝关节骨性关节炎急性期的治疗作用及对SOD、NO及MDA的影响［J］.海峡药学，2013，25（5）：97-98.

［14］高 志，邓友章.中药骨筋宝汤对膝关节骨性关节炎患者血清SOD、NO及MDA水平的影响［J］.海南医学院学报，2012，18（3）：341-343.

R285.5

B

1001-1528（2015）08-1810-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.039

2014-04-15

国家自然科学基金面上项目 （81373929）；国家自然科学基金面上项目 （81473359）；黑龙江中医药大学新药基金（X200903）；黑龙江省自然科学基金 （H201472）

郭玉岩（1982—），硕士，讲师，从事中药新药开发研究。Te1：13845046561，E-mai1：guoyuyan622@163.com

*通信作者：李永吉（1957—），教授，医学博士，从事新药制剂技术开发。E-mai1：1iyongji2009@163.com