二氢杨梅素诱导凋亡抗肿瘤作用

左彦珍， 孙大永， 毕红东， 丁 实， 周 健， 鲁艳杰

（1.承德医学院药理教研室，河北 承德067000；2.承德市中心医院放化疗中心，河北 承德067000；3.承德医学院病理教研室，河北承德067000）

二氢杨梅素诱导凋亡抗肿瘤作用

左彦珍1， 孙大永2*， 毕红东1， 丁 实1， 周 健1， 鲁艳杰3

（1.承德医学院药理教研室，河北 承德067000；2.承德市中心医院放化疗中心，河北 承德067000；3.承德医学院病理教研室，河北承德067000）

目的以HeLa细胞为研究对象，研究二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）的诱导凋亡作用，进一步研究和验证DMY诱导肿瘤凋亡的作用和机制，为探索研发治疗宫颈癌新药提供思路的同时，对DMY在抗肿瘤方面的应用提供进一步的资料。方法倒置显微镜观察给药后细胞形态的变化，MTT实验研究DMY对于HeLa细胞的抗肿瘤作用，流式细胞术研究DMY对HeLa细胞的诱导凋亡作用，Western b1otting检测促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bc1-2表达水平，进一步探讨其机制。结果DMY浓度越大，对HeLa细胞的抑制作用越明显，48 h的IC50约125μg/m1；流式细胞术显示在DMY为140μg/mL时HeLa细胞凋亡明显；Western b1otting结果显示DMY可诱导HeLa细胞中Bax蛋白表达增加，同时Bc1-2蛋白减少。结论DMY可以通过诱导HeLa细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。

二氢杨梅素；细胞凋亡；宫颈癌；流式细胞术

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）是葡萄科藤茶植物黄酮提取物中的主要活性成分二氢黄酮类化合物，近些年研究显示DMY可以通过抑制侵袭、抗增殖、促凋亡等机制发挥抗肿瘤的作用，很可能成为一种低毒高效的抗肿瘤药物。另外有研究显示黄酮类化合物还可以增加肿瘤放化疗的敏感性［1］。宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，2008年的统计资料显示，宫颈癌是女性第三常见的恶性肿瘤，居妇科恶性肿瘤发病率首位，新发病例52.9万，85%发生在发展中国家，死亡病例27.4万［2］，且近二十年来发病日趋年轻化，严重威胁着女性的身体健康和生命。手术、放疗、化疗和综合治疗是治疗癌症的主要手段。手术治疗是早、中期宫颈癌的一种重要治疗手段，有较好的治疗效果，但经根治术治疗后约有30%未控或者复发［3］。手术辅以化疗能够提高治愈率，降低复发和转移风险，提高生存率，改善患者生存质量［4］，但是目前临床上常用的化疗药物多为顺铂、5-氟尿嘧啶等细胞毒类药物，毒副作用比较重。本研究以HeLa细胞为对象，研究二氢杨梅素对宫颈癌的抗肿瘤作用，探索二氢杨梅素诱导肿瘤凋亡的作用和机制，以期探索和研发新的抗宫颈癌药物，为提高宫颈癌的治愈率提供新思路，同时也为二氢杨梅素在抗肿瘤方面的应用开发提供进一步的资料。

1 材料

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）国家标准物质对照品，批号MUST-13013108，纯度99%以上。改良型RPMI-1640培养液、PBS磷酸盐缓冲液、胎牛血清 （FBS）均购自HyC1one公司，0.25%胰酶（Sigma），培养皿和培养板（Corning），流式细胞凋亡试剂盒（联科生物）。Bc1-2和Bax为兔抗人单克隆抗体（EPITOMICS公司）。宫颈癌HeLa细胞系由承德医学院中心实验室提供。

2 方法

2.1 细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞加入含100 U/m L青霉素和100μg/mL链霉素的10%FBS的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。当细胞长满培养皿的80%左右，用0.25%含EDTA的胰酶消化传代。取对数生长期细胞进行实验，倒置显微镜下观察细胞的形态和生长状态。

2.2 MTT法检测二氢杨梅素对HeLa细胞抗增殖作用 取对数生长期细胞，消化收集细胞，并将细胞密度调整至1× 104个/mL，按照实验的不同分组，于96孔板中每孔接种0.1mL，每组设6个复孔，分别设空白组、对照组和不同药物浓度组。24 h后细胞贴壁并处于对数生长期时，将培养基换成含不同浓度二氢杨梅素的等体积培养基继续培养48 h，在培养结束前4 h每孔加入5 mg/mLMTT 10μL，继续培养4 h后小心弃培养基，每孔加入150μL DMSO，使结晶充分溶解，酶标仪490 nm处检测各孔吸光度，计算细胞生长抑制率（抑制率=对照组OD-药物组OD）/对照组OD×100%），并利用IC50软件计算药物的IC50值。实验重复4次，取平均值。

2.3 流式细胞术分析细胞凋亡 对数生长期HeLa细胞，以不同浓度二氢杨梅素作用48h后用不含EDTA的胰酶消化制成单细胞悬液，按照流式凋亡试剂盒的步骤收集细胞，并加入相应的AV、PI染色，用BD FACSCa1ibur流式细胞仪在激发波长488nm处检测细胞凋亡情况，并用随机软件进行分析，实验重复3次。

2.4 Western b1otting检测Bax和Bc1-2的蛋白表达 对数生长期细胞给予不同质量浓度二氢杨梅素 （0、100、140 μg/mL）作用48 h，加入裂解液充分裂解，低温反复冻融3次，4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清，提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行定量，SDS-PAGE电泳，稳压电泳进行聚偏乙烯 （PVDF）膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗按一定比例稀释后 （Bc1-2、Bax：1∶1 000，βactin：1∶1 000）4℃孵育过夜，分别加入HRP标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，增强型化学发光（ECL），显影，免疫印迹条带应用Quntity One 4.62软件进行定量分析。

2.5 统计学方法 应用统计学处理软件SPSS 17.0进行单因素方差分析，数据以表示，选取P＜0.05为显著性检验标准。

3 结果

3.1 二氢杨梅素对HeLa细胞形态的影响 不同质量浓度二氢杨梅素对HeLa细胞处理48 h后，可见空白对照组细胞生长贴壁良好，细胞间隙小，形态均一，呈胖三角形团簇状生长，克隆增殖良好；随着二氢杨梅素质量浓度的增高，细胞固缩变圆，细胞间隙明显增大，贴壁能力下降，克隆增殖能力下降明显，细胞密度同对照组相比明显减少（图1）。

图1 不同质量浓度二氢杨梅素作用HeLa细胞48 h后形态变化 （×40）

3.2 MTT法检测二氢杨梅素对HeLa细胞的抗增殖作用

不同质量浓度二氢杨梅素作用48 h后，HeLa细胞的增殖明显被抑制 （P＜0.05），且随着二氢杨梅素质量浓度的增加，抑制作用越显著，其IC50约125μg/mL。见图2。

图2 二氢杨梅素对HeLa细胞的体外抗增殖作用（n=6）

3.3 流式细胞仪检测二氢杨梅素对HeLa细胞的诱导凋亡作用 流式细胞仪检测显示，经不同质量浓度的二氢杨梅素 （0、100、140μg/mL）干预48 h后，HeLa细胞的凋亡率分别为15.36%±2.6%、35.43%±1.6%、75.08%± 5.8%，可见随着药物质量浓度的增加，凋亡也越明显（P＜0.01），尤其140μg/m L组大部分细胞已经凋亡 （P＜0.01），见图3。

3.4 Western b1otting检测蛋白表达 β-actin条带各组表达均一，总蛋白量相同。二氢杨梅素干预后，可见随着药物质量浓度的增加，Bax表达逐渐增加，Bc1-2表达逐渐减少，尤其140μg/mL组显著（P＜0.05）；与MTT结果一致（图4）。

4 讨论

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，在肿瘤的发生发展和治疗中起着重要的作用，通过诱导和调控凋亡通路来诱导肿瘤细胞凋亡是目前治疗肿瘤的一个重要途径［5］。另外诱导肿瘤细胞凋亡是黄酮类化合物增加放化疗治疗敏感性，降低治疗副反应的重要途径之一［1］。二氢杨梅素是我国近几年开发的新的黄酮类化合物，有研究显示二氢杨梅素可以通过诱导肿瘤细胞AGZY-83-a凋亡发挥抗肿瘤作用［6］。研究黄酮类化合物二氢杨梅素通过诱导凋亡途径在HeLa细胞发挥抗肿瘤作用不仅可以为宫颈癌的治疗提供新的思路，也可以进一步明确二氢杨梅素发挥抗肿瘤作用的机制，为二氢杨梅素在抗肿瘤和肿瘤增敏治疗药物开发利用方面提供实验资料。

图3 流式细胞术AV/PI双染检测不同质量浓度二氢杨梅素诱导HeLa细胞的凋亡（n=3）

图4 Western blotting检测不同质量浓度二氢杨梅素作用后Bax/Bcl-2蛋白表达（n=3）

MTT实验显示二氢杨梅素在体外对HeLa细胞有抗增殖作用，并且随着药物质量浓度的增加作用也越显著。诱导细胞凋亡是药物发挥抗肿瘤作用的重要机制之一，因此实验进一步通过流式细胞术检测了二氢杨梅素对HeLa细胞的诱导凋亡作用，结果同MTT一致，随着药物浓度的增加HeLa细胞凋亡率也明显增加。

Bc1-2家族蛋白在细胞凋亡调控信号中起着重要作用，按其功能主要分为两大类：即促凋亡蛋白Bax、Bak、Bid和抗凋亡蛋白Bc1-2、Bc1-xL等［7］。Bc1-2可通过调控细胞膜通透性来阻止细胞色素C释放，从而阻止细胞凋亡的级联反应。Bc1-2的高表达已成为肿瘤细胞逃逸凋亡的重要机制之一，抑制Bc1-2表达可明显上调肿瘤细胞的凋亡率。而凋亡蛋白Bax的功能恰恰相反，位于细胞质的Bax受到凋亡信号的刺激后，形成二聚体并插入线粒体膜，从而诱导线粒体膜的电位降低，促进细胞色素C释放，诱发细胞凋亡级联反应［8］。Bc1-2与Bax可相互拮抗，当细胞受到促凋亡因素刺激时，两者的比率决定细胞的存亡［9］。当Bc1-2/Bax比值上调时，细胞对死亡的信号反应性就会降低，从而使凋亡受到抑制；Bc1-2/Bax比值下调时，细胞对死亡信号的反应性增强，促进了凋亡的发生［10］。在甘草酸对人肺癌细胞A549的研究中显示下调抑凋蛋白Bc1-2表达和上调促凋蛋白Bax表达可以诱导细胞的凋亡［11］；白藜芦醇可以通过提高Bc1-2/Bax蛋白表达比减少神经细胞凋亡［12］；槲皮素可以通过调控Bax蛋白增加和Bc1-2蛋白减少而抑制小细胞肺癌H446的增殖并促进其凋亡［13］。本研究中蛋白印迹结果显示二氢杨梅素质量浓度越高Bax蛋白表达量越高，而Bc1-2蛋白表达则减少。提示MTT实验中二氢杨梅素抗增殖和流式实验中二氢杨梅素诱发凋亡可能与下调Bc1-2/Bax比值有关。由此可见，二氢杨梅素与其他黄酮类化合物一样都能促进细胞凋亡，这种促进凋亡的作用与下调Bc1-2/Bax比值有关。

综上所述，本研究显示二氢杨梅素对宫颈癌HeLa细胞有抗肿瘤作用，其机制可能与激活了Bc1-2/Bax参与调控的凋亡通路有关。二氢杨梅素发挥抗肿瘤作用是否还与其它通路有关需要进一步研究，另外二氢杨梅素在体内是否也能发挥抗肿瘤作用我们将做进一步研究。但是有研究显示二氢杨梅素不仅在体外能够抑制乳腺癌等肿瘤细胞的增殖［14］，活体条件下也可以显著抑制人肺癌GLC82裸鼠移植瘤和人肝癌Be1-7402裸鼠移植瘤的生长［15-16］，并且刘德育等发现二氢杨梅素在不产生毒素的作用下就可以显著抑制黑色素瘤细胞B16的侵袭黏附，对黑色素瘤的抑制作用与目前临床抗黑色素瘤的首选药氮烯咪胺相当［17］。苏东林等［18］在二氢杨梅素的急性毒理学评价中也发现二氢杨梅素毒性很小，毒副作用不明显，Wistar大鼠口服灌胃的最大耐受量为5.0 g/kg。并且二氢杨梅素低毒高效的同时还有保护肝脏、降血脂、抗氧化、提高免疫力等优点［19］。这些都提示二氢杨梅素在作为抗癌药物开发利用方面有巨大潜力。但是藤茶和二氢杨梅素的研究近几年刚刚开始，加之藤茶主要产于我国，国外鲜有报道。本实验结果二氢杨梅素体外抗宫颈癌作用的存在可以为二氢杨梅素在抗肿瘤方面的应用开发提供进一步的资料，并可为我国开发天然植物抗肿瘤药提供新思路。

［1］宋梦姣，刘 宏，申玉莉.黄酮类放射增敏剂的研究进展［J］.中国医院药学杂志，2013，12（33）：997-999.

［2］Fer1ay J，Shin H R，Bray F，et al.Estimates ofwor1dwide burden of cancer in 2008：GLOBOCAN 2008［J］.Int JCancer，2010，127（12）：2893-2917.

［3］Rotman M，Sed1is A，Piedmonte M R，et al.A phase III randomized tria1of postoperative pe1vic irradiation in Stage IB cervica1 carcinoma with poor prognostic features：fo11ow-up of a gyneco1ogic onco1ogy group study［J］.Int JRadiat Oncol Biol Phys，2006，65（1）：169-176.

［4］彭 茸，赵纯全.化疗药物在宫颈癌治疗中的应用及研究进展［J］.中国药房，2013，24（12）：1143-1146.

［5］李 然，刘立萍，马 冀，等.小柴胡汤含药血清对肝癌HepG-2细胞的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：217-220.

［6］尹梅梅，潘振伟，蔡本志，等.二氢杨梅素诱导人肺腺癌细胞系AGZY-83-a凋亡的实验研究［J］.中国药理学通报，2008，24（5）：626-630.

［7］Cao X，Liu B，Cao W，et al.Autophagy inhibition enhances apigenin-induced apoptosis in human breast cancer ce11s［J］. Chin JCancer Res，2013，25（2）：212-222.

［8］Ghoneum M，Matsuura M，Bmga M，et al.S.cerevisiae induces apoptosis in human metastatic breast cancer ce11s by a1tering intrace11u1ar Ca2+and the ratio of Bax and Bc1-2［J］.Int J Oncol，2008，33（3）：533-539.

［9］Bar-Am O，Weinreb O，Amit T，etal.Regu1ation of Bc1-2 fami1y proteins，neurotrophic factors，anc APP processing in the neurorescue activity of propargy1amine［J］.FASEB J，2005，19（13）：1899-1901.

［10］Korbakis D，Scori1as A.Quantitative expression ana1ysis of the apoptosis-re1ated genes BCL2，BAX and BCL2L12 in gastric adenocarcinaoma ce11s fo11owing treatmentwith the anticancer drugs cisp1atin，etoposide and taxo1［J］.Tumour Biol，2012，33（3）：865-875.

［11］李艳茹，陆国辉，高健美.甘草酸对人肺癌细胞A549凋亡及Bc1-2和Bax表达的影响［J］.中药药理与临床，2014，30（1）：23-25.

［12］朱开梅，姚丽新，刘建楠，等.构树叶总黄酮对人肝癌细胞HepG-2增殖和凋亡的作用及其机制研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：270-273.

［13］刘 涛，张雅雅，许英艺，等.槲皮素对人小细胞肺癌H446细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2014，21（2）：169-174.

［14］周防震，张晓元，郭 勇.二氢杨梅素抗肿瘤活性及其机制的研究进展［J］.中华中医药学刊，2010，28（9）：1914-1916.

［15］曾 飒，刘德育，叶燕丽，等.蛇葡萄素对人肺癌GLC-82裸鼠移植瘤的抑制作用［J］.中药材，2004，27（11）：842-845.

［16］罗高琴，曾 飒，刘德育.蛇葡萄素的血管生成抑制作用［J］.中药材，2006，29（2）：146-150.

［17］刘德育，丘明祺，梁婷韵.无刺根中蛇葡萄素的提取及其对黑色素瘤的抑制作用［J］.中山医科大学学报，1999，20（2）：127-129.

［18］苏东林，黄继红，姚茂君.二氢杨梅素的急性毒理学评价及对酒精性肝损伤的防治效果［J］.湖南农业科学，2009（11）：90-93.

［19］朱 哲，杨悟新，强烈应，等.二氢杨梅素研究进展［J］.武警医学院学报，2011，20（7）：600-604.

R966

B

1001-1528（2015）08-1849-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.050

2014-11-12

河北省高等学校科学技术研究项目 （QN2014036）；河北省卫生厅重点课题 （ZL20140247）；承德市科学技术研究项目（20142015）；承德医学院自然科学项目 （201407）；河北省高校病理与病理生药学重点学科项目 （冀教高2013）

左彦珍（1981—），女，硕士，讲师，主要从事肿瘤药物研究。Te1：（0314）42291149，E-mai1：yanzhen926@163.com

*通信作者：孙大永 （1980—），男，硕士，主治医师，主要从事肿瘤临床研究。Te1：（0314）2020075，E-mai1：109024380@qq.com