骨髓组织印片在急性白血病化疗后形态学评估中的价值

莫伟明 刘军 叶君 杨爱平 陈琴琴 楚旭 苏萍 周其良

骨髓组织印片在急性白血病化疗后形态学评估中的价值

莫伟明 刘军 叶君 杨爱平 陈琴琴 楚旭 苏萍 周其良

目的 探讨骨髓组织印片在急性白血病化疗后形态学评估中的实用价值。方法 收集126例次急性白血病患者化疗后同步进行骨髓涂片、组织印片和切片检查结果，比较骨髓涂片、组织印片和切片在有核细胞量、缓解度、诊断符合率性能指标中的差异。结果 组织印片与骨髓涂片在有核细胞量分级分布差异有统计学意义（P=0.000），而组织印片与切片无统计学差异（P=0.997）。组织印片与骨髓涂片在显示缓解度分布有统计学差异（P=0.003），而组织印片与切片无统计学差异（P=0.955）。以切片显示缓解度为标准：切片完全缓解（CR）组中，组织印片与涂片符合率无统计学差异（98.6%、100%，P=1.000）；切片部分缓解（PR）组中，组织印片与骨髓涂片符合率有统计学差异（88.4%、46.5%，P=0.000）；切片未缓解（NR）组中，组织印片与骨髓涂片符合率有统计学差异（84.6%、38.5%，P=0.041）；组织印片在灵敏度、特异度、阳性预测值、阳性似然比、Youden指数等性能指标总体上优于骨髓涂片。结论 骨髓组织印片兼有涂片和切片的特征，组织印片联合骨髓涂片互补性检查，对急性白血病化疗后骨髓造血评估具有明显优势。

骨髓组织印片 急性白血病 诊断 价值

骨髓检查是评估各种疾病包括肿瘤和非肿瘤性血液疾病的重要诊断方法，骨髓穿刺涂片（bone marrow aspiration，BMA）、骨髓组织印片（bone marrow imprint, BMI）和骨髓活检切片（bone marrow biopsy，BMB）是其3个基本的细胞学检查项目[1]。目前，急性白血病（acute leukemia，AL）骨髓检查完全缓解（complete remission，CR）标准仍以光镜下BMA中原始细胞≤5%作为主要指标[2]，但由于白血病细胞间吸附力、细胞与间质黏着力、细胞塞实程度等因素影响，抽吸髓液时容易被稀释，导致BMA难以真实的反映骨髓造血及肿瘤细胞增生情况。近年来，国内外对于BMA与BMB比较诊断报道较多[3-4]，但兼有BMA和BMB特征的BMI尚未引起人们的足够重视，较少有报道BMI对于AL化疗后骨髓细胞缓解度评估中的价值。因此，笔者回顾了126例次AL患者化疗后同步进行的BMA、BMI及BMB检查结果，并评估其检查方法在显示有核细胞量、缓解度、诊断符合率中的差异，探讨BMI在AL患者化疗后骨髓细胞形态学评估中具有独特的诊断价值，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2006年6月至2014年7月在我院确诊AL患者73例，其中男38例，女35例，年龄23～82（46.2±13.3）岁。AL诊断标准均参照张之南主编《血液学诊断及疗效标准》[5]诊断标准，其中急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）11例，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）62例（FAB分型：M01例，M12例，M223例，M312例，M416例，M56例，M62例），在血液科化疗后进行126例次同步BMA、BMI及BMB检查。

1.2 方法

1.2.1 BMA、BMI及BMB制备及染色 患者髂后上棘抽吸髓液制成BMA后，采用国产B65-01型骨髓活检针以环钻二步法获取骨髓组织（长度在0.5cm以上），将针内骨髓组织置于载玻片上，用2张玻片面对面轻轻均匀滚动组织制成BMI（骨髓组织放入Bouin固定液），BMI与BMA同步进行Wright－Giemsa染色；骨髓组织经浓度逐级递增的乙醇进行组织脱水、漂洗、吸干、包裹、切片、贴片与烤片制成BMB，行常规组织化学染色，苏木素-姬姆萨-酸性品红（haematoxylin-giemsa-fuchsin，HGF）、网状纤维染色和免疫组化CD34。

1.2.2 评估BMA、BMI及BMB显示有核细胞量差异 BMA与BMI有核细胞量评定方法采用显微镜（日本Olympus公司，BX40）油镜下观察10个视野计算平均有核细胞数，将有核细胞量划分为极度减少、明显减少、轻度减少、正常、轻度增多、明显增多、极度增多7个等级，上述7个等级有核细胞量均值分别对应为＜5个、5～14个、15～24个、25～50个、51～70个、71～90个、＞90个[6-7]；BMB有核细胞量评估参照浦权主编《血液病骨髓诊断病理学》[8]，以计点法检测造血组织所占容积评估有核细胞量（骨髓增生程度），对于上述7级别的有核细胞百分比分别为＜10%、11%～25%、26%～40%、41%～64%、65%～77%、78%～90%、＞90%。比较BMA、BMI及BMB显示有核细胞量差异。

1.2.3 评估BMA、BMI及BMB显示缓解度差异 观察BMA和BMI显示缓解度是在光镜下（×1 000）分类计数200个有核细胞，计算原始细胞百分比含量（%）；观察BMB显示缓解度是在光镜（×400）下观察其原始细胞并依据免疫组化CD34阳性率，估算原始细胞所占有核细胞比例（通常为约数）。将AL患者化疗后缓解程度依据原始细胞量划分3组[2，9]：CR：原粒细胞≤5%；部分缓解（partial remission，PR）：5%＜原粒细胞≤20%；未缓解（non-remission，NR）：原粒细胞＞20%。原始细胞定义范围包括[9]：原始粒细胞、原始单核细胞+幼稚单核细胞、原始巨核细胞、异常早幼粒细胞（M3）、原始淋巴细胞+幼稚淋巴细胞（ALL）。评价BMA、BMI及BMB之间显示缓解度差异。

1.2.4 BMA和BMI诊断指标性能评价 以BMB显示缓解度为金标准，灵敏度（%）=真阳性数/（真阳性数+假阴性数）×100%；特异度（%）=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）×100%；阳性似然比=灵敏度/（1-特异度）；阳性预测值=真阳性/（真阳性+假阳性）；Youden指数=灵敏度+特异度-1。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 126例次AL患者化疗后BMA、BMI及BMB显示有核细胞量（增生程度）分布比较 见表1。

表1126 例次AL患者化疗后BMA、BMI及BMB显示有核细胞量分布比较[例次（%）]

由表1可见，BMI与BMA在有核细胞量分级分布中有统计学差异（χ2=29.452，P=0.000），而BMI与BMB间比较差异无统计学意义（χ2=0.589，P=0.997）。BMI与BMB有核细胞量分级分布中相同率达96.0%（121/ 126），而BMI与BMA仅有70.6%（89/126）相同。

2.2 126例次AL患者化疗后BMA、BMI及BMB显示缓解度分布的比较 见表2。

表2 126例次AL患者化疗后BMA、BMI及BMB显示缓解度分布比较[例次（%）]

由表2可见，BMI与BMB显示缓解度分布的差异无统计学意义（χ2=0.092，P=0.955），BMI显示缓解度评估性能接近于BMB；而BMI与BMA显示缓解度分布差异有统计学意义（χ2=11.389，P=0.003）。96例BMA显示CR中BMI、BMB共同显示CR仅为55.6%（70/126），部分在BMA中显示CR，却在BMI和BMB中显示为PR或NR。

2.3 BMA和BMI显示缓解度符合率及各项性能指标的评价 见表3。

表3 BMA和BMI显示缓解度符合率及各项性能指标的评价

由表3可见，在BMB显示CR组中，BMI符合率为98.6%（69/70）与BMA 100%（70/70）差异无统计学意义（χ2=0.000，P=1.000）；BMB显示PR组中，BMI符合率88.4%(38/43)明显高于BMA 46.5%（20/43），差异有统计学意义（χ2=17.158，P=0.000）；BMB显示NR组中，BMI符合率84.6%（11/13），明显高于BMA 38.5%（5/ 13），差异有统计学意义（χ2=5.850，P=0.041）。在BMB显示CR组中，除灵敏度外，特异度、阳性预测值、阳性似然比、Youden指数均优于BMA；在BMB显示PR组中，灵敏度、特异度、阳性预测值、阳性似然比、Youden指数全部指标均优于BMA；在BMB显示NR组中，灵敏度、Youden指数优于BMA。

3 讨论

随着血液学的发展，免疫学、细胞遗传学、分子生物学技术在血液系统疾病中的应用，AL的CR含义不断深入，出现了细胞遗传学CR、分子生物学CR，以及应用流式细胞技术检测CR后的微小残留病变（minimal residual disease，MRD），但国内外专家均认为基础的细胞形态学仍然是评价肿瘤和非肿瘤性血液病的一种不可或缺的检查方式，它对于AL后续的化疗监测非常重要[2，10-11]。BMA检查方法简便、快速，在观察细胞形态、细胞数量、细胞比例上变化见长，但其不足之处也为人们所共识，譬如抽吸液稀释、骨髓基质对细胞的黏附力、推片力度等原因，涂片难以真实的反映骨髓造血情况。BMB可以弥补BMA的不足，临床实践已经发现BMA显示CR时部分患者同期的BMB仍可发现散在的原始细胞灶或幼稚前体细胞异常定位（abnormal localization of immature precursors，ALIP），是非真正意义上的CR[12-14]，但其检查操作复杂、出报告周期长（至少48～72h）[10，15-16]。现阶段，国内BMA细胞形态学与BMB组织病理学检查大多属于不同科室进行检查，造成两种方法不能有效地结合，影响了两者相互叠加的诊断价值。BMI却兼有BMA和BMB的特征，可与BMA同步互补镜检，可以正确快速评估AL化疗后真实的骨髓造血及缓解程度。

笔者通过对AL化疗后同步进行的BMA、BMI及BMB检查结果分析发现，BMI最实用和最有意义的价值是对骨髓有核细胞量的评估，细胞量的增多会使诊断变得更加明确和容易。本研究结果显示，BMI在有核细胞量分级评估性能与BMB接近（P＞0.05），而BMI评估性能优于BMA（P＜0.05）。由此可见，BMA由于穿刺稀释或受白血病细胞塞实的影响，未能客观反映骨髓有核细胞增生的实际情况，而BMI能较客观地显示了骨髓增生的真实程度，可以矫正BMA在显示有核细胞量方面的欠正确性。BMI是将骨髓组织直接在玻片上印制，干扰因素明显比骨髓穿刺和骨髓液制成的BMA少，故一般情况下，BMI的有核细胞量要高于BMA[17]。BMI可避免再次骨髓穿刺的困惑，可迅速及时地对BMA欠缺的标本提供有价值的诊断信息。AL患者BMI显示有核细胞量增生活跃或明显活跃时，可适当延长化疗时间，将有利于提高缓解的质量，延长缓解期和患者生存期[14]。

目前，国际上通用的判断骨髓细胞形态学CR的标准为：在骨髓抽吸涂片细胞数足够的情况下（＞20%），骨髓中原始细胞比例≤5%，无Auer小体；同时外周血中无可检测到的原始细胞，且中性粒细胞≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L[18]。笔者通过对AL患者化疗后BMA、BMI及BMB显示缓解度比较发现，BMI与BMB显示缓解度分布大致相同或比较接近（P＞0.05），而BMI明显优于BMA（P＜0.05）；笔者以BMB显示缓解度为金标准，发现BMI诊断符合率（灵敏度）、特异度、阳性预测值、阳性似然比、Youden指数等指标优于BMA。由此可见，BMI比BMA更能真实的反映AL化疗后骨髓原始细胞残留情况，更准确的评估细胞学缓解程度。万楚成等[13]报道46例AL患者BMA已经显示CR，与此同时BMI显示CR仅65.2%（30/46），PR多达23.9%（11/46），NR也有10.9%（5/46）。顾凤兰等[14]报道43例次BMA显示CR,BMI显示CR仅25例，而PR 13例、NR 5例。笔者认为BMI有核细胞虽未受人为推片推开，胞体相互挤压变形，影响了部分细胞密集区域形态学观察，但在有核细胞分布相对宽松的区域基本可以识别出原始细胞。BMB中出现ALIP结构或原始细胞小灶性增生时，BMA显示原始细胞比例常低于同期进行的BMB，因为网硬蛋白纤维可阻留部分原始细胞，ALIP和原始细胞小灶结构在抽吸和涂片过程中已经解体并分散于整个涂片，加之骨髓纤维化导致骨髓抽吸稀释。与此同时，BMI常出现原始或早期细胞集积性增生，可以弥补单纯BMA检查的不足,能比BMA更接近真实地反映造血组织中的病变。因此，BMA显示CR，还不能认为真正达到CR，BMA不能客观的反映骨髓肿瘤细胞真实的增生情况，会造成部分患者骨髓细胞学缓解的假象。如单纯依靠BMA结果，部分患者得不到进一步的诱导治疗或虽然经诱导治疗仍未达到CR者，绝大多数患者在短期内复发[13-14]。BMI是连接BMA与BMB检查的纽带，BMI能更客观的反映骨髓原始细胞残留量,与BMA互补检查能更快速、准确的指导临床治疗，进一步提高AL的疗效。

综上所述，在基层血液病实验室细胞遗传学、分子生物学等检测手段尚难以开展的情况下，BMI可以弥补部分BMA和BMB的不足，BMI与BMA快速同步在检验科进行细胞形态学互补检查，能更好的指导临床早期、快速、正确的评估AL化疗后骨髓有核细胞量、原始细胞残留量、缓解度,值得推广。

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Application of bone marrow imprints in diagnosis of acute leukemia after chemotherapy

MO Weiming,LIU Jun,YE Jun,et al.
Department of Clinical Laboratory,Zhejiang Xiaoshan Hospital,Hangzhou 311202,China

【 Abstract】 Objective To evaluate the application of bone marrow imprints in diagnosis of acute leukemia after chemotherapy. Methods Bone marrow aspiration,bone marrow imprints and bone marrow biopsy of 126 patients with acute leukemia after chemotherapy were collected.The amount of nucleated cells,the degree of remission,diagnostic accordance rate was compared among three methods. Results The grading distribution of nucleated cells in bone marrow imprints was significantly different to bone marrow aspiration (χ2=29.452,P=0.000),but close to that of bone marrow biopsy(χ2=0.589,P=0.997).The degree of bone marrow remission shown on bone marrow imprints was significantly different to that on bone marrow aspiration (χ2=11.389,P=0.003),and close to that on bone marrow biopsy(χ2=0.092, P=0.955).With the results of bone marrow biopsy as gold standard,the diagnostic accordance rates in complete remission(CR)for bone marrow aspiration and bone marrow imprints were 98.6%and 100.0%,respectively(Fisher's exact probability P=1.000);the accordance rates in partial remission(PR)for bone marrow aspiration and bone marrow imprints were significantly different(88.4%,46.5%,χ2=17.158,P=0.000);the accordance rates in non-remission(NR)for bone marrow aspiration and bone marrow imprints were significantly different(84.6%,38.5%,χ2=5.850,P=0.041).The overall sensitivity,specificity,positive predictive value,positive likelihood ratio,Youden index of bone marrow imprints were better than those of bone marrow aspiration. Conclusion Bone marrow imprints with characteristics of both bone marrow aspiration and bone marrow biopsy,have advantages for assessment of bone marrow hematopoietic in acute leukemia after chemotherapy.

Bone marrow imprints Acute leukemia Diagnosis Value

2014-12-09）

（本文编辑：严玮雯）

311202 杭州，浙江萧山医院检验科（莫伟明、刘军、叶君、杨爱平、陈琴琴、楚旭），血液科（苏萍、周其良）

莫伟明，E-mail：moweiming@zjxsh.com