天麻最细粉对帕金森病大鼠脑内神经递质及环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷的调节作用

刘 玮 曹燕滔 艾 国

1.空军总医院神经内科，北京 100036；2.武警总医院干三科，北京 100039；3.空军航空医学研究所，北京 100142；4.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种老年神经系统退变性疾病，主要的病理特征不仅包括引起核心的运动障碍症状的黑质-纹状体多巴胺能系统变性，而且包括中枢、外周和自主神经系统的多靶点侵犯，并伴有广泛的路易小体和路易轴突的形成，从而引起基底神经节的功能失调[1]。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍四大核心症状为主要表现，病程呈慢性进展性[2]。 据统计全球65 岁以上老年人中，有1%的人患有PD，而到了80 岁，患病率将增加5 倍。在我国，PD 的发病率更高。目前，我国有200 万PD 患者，且年增10 万新患者。 该病的治疗目前无论药物或手术，只能改善其症状，不能阻止病情的发展，更无法治愈，给患者以及全社会都造成十分严重的负担。 对PD 的治疗和研究工作刻不容缓。

在PD 发生发展过程中，由于中脑多巴胺（dopamine，DA）产生的减少引起全身多部位的神经递质发生紊乱，如去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）和5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）。 这些神经递质的合成、分泌发生紊乱，引发了基底神经节网络调控功能失调，导致运动不能症状的出现。在之前的实验中，笔者采用6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）建立了PD 大鼠模型，发现经过天麻普通粉和最细粉的治疗后，无论是在改善PD 大鼠的神经行为学方面，还是在减轻PD 大鼠氧化应激损伤和神经炎性反应方面，天麻最细粉的治疗效果均要优于普通粉[3]。为了进一步确证天麻最细粉对于PD 大鼠的治疗作用，本文探讨了天麻最细粉和普通粉对PD 大鼠学习记忆能力的改善作用，以及对PD 大鼠脑内3 种神经递质——DA、NE 和5-HT 的影响。 此外，环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monoph-osphate，cGMP）是细胞功能的重要调节物质，在细胞代谢及多种生理效应的体现中具有关键的作用[4]。 笔者继而测定了PD 大鼠经过天麻最细粉和普通粉治疗后血清中cAMP、cGMP 的含量，为天麻最细粉的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物

天麻（Gastrodia elata）原产地贵州，普通粉（D50=157.10 μm）和最细粉（D50=27.44 μm）均由四川金岁方药业有限公司提供。 两种粉体的电镜照片见图1。

图1 天麻普通粉（A）和最细粉（B）的扫描电镜照片（500×）

1.2 动物

健康Wistar 雄性大鼠，体重195～210 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号为医动字SCXK-（军）2002-2001。

1.3 试剂与仪器

盐酸氯胺酮注射液（北京双鹤药业股份有限公司，0.1 g/2 mL）；6-OHDA、盐酸去水吗啡、DA 盐酸盐、NE 盐酸盐和5-HT 盐均购自美国Sigma 公司；大鼠cAMP 酶免试剂盒、大鼠cGMP 酶免试剂盒均由成都光海科技有限公司提供；Waters 高效液相色谱仪（Millennium 32 色谱工作站，Waters460 电化学检测器，美国Waters 公司）；色谱柱为AlltimaTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Alltech 公司）；AE163天平（瑞士Mettler 公司）；大鼠脑立体定位仪（轩泰仪北京科技有限公司）；微量进样器（上海安亭微量进样器厂）。

1.4 分组及给药

PD 模型的制备如前所述[3]。 挑选造模成功的PD大鼠随机分为模型组、天麻普通粉组（1.8 g/kg）、天麻最细粉组（1.8 g/kg），每组10 只，另纳入10 只正常大鼠为正常组。将天麻普通粉和最细粉分别加入适量蒸馏水配制成2 g/mL 的混悬液，临用现配，摇匀取用灌胃给药。天麻普通粉和最细粉在造模成功后分别以相应的粉体混悬液灌胃给药，每天1 次，连续3 周。正常组和模型组以蒸馏水代替药材，其他均相同。

连续给药3 周后，用Morris 水迷宫测试大鼠的学习记忆能力。之后，各组大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射20%乌拉坦溶液（10 mL/kg）麻醉，于枕骨大孔处断头处死，腹主动脉取血，制血浆，待测cAMP 和cGMP含量。 在冰皿上迅速分离双侧脑组织，取脑组织块0.3～0.4 g，在4℃的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，电子天平称重，再加入4℃生理盐水后匀浆。将匀浆液以4000 r/min 离心15 min。 将上清液置-80℃冰箱中备用，测定脑组织中神经递质的含量。

1.5 学习记忆能力检测

采用Morris 水迷宫测试其学习记忆能力。 前4 d为训练时间，第5 天为测试时间。训练每天上午进行，训练5 次，每次间隔15 min，每次将大鼠面向池壁分别从4 个象限的4 个入水点入水，记录其在60 s 内寻找平台的时间，即逃避潜伏期。 如果达60 s 仍未找到平台，则引导其到达平台，停留30 s，本次成绩计为60 s，然后进行下次训练。 测试时取消平台，同法观察各组大鼠逃避潜伏期[6]。

1.6 脑组织中神经递质含量的测定

神经递质含量的测定采用高效液相色谱-电化学检测法[7]。取脑组织匀浆，加正丁醇5 mL，混匀，于4℃下离心（5000 r/min）15 min。 取上清液，加HClO4（0.1 mol/L）0.15 mL，正庚烷0.2 mL，旋涡振荡3 min 后离心（3000 r/min）。除去有机相，在下层的水相中加入1 mL CHCl3，经旋涡振荡3 min、低速离心3 min 后，取水相直接进样，进样量20 μL。 流动相为缓冲液（0.1 mol/L柠檬酸三钠和0.1 mol/L 磷酸氢二钠） ∶甲醇=90∶10 的溶液，经0.45 μm 滤膜过滤并超声脱气后使用，流速为1 mL/min。 电化学监测器设定电压为+650 mV。 洗脱顺序依次为NE、DA、5-HT。

1.7 血清中cAMP 和cGMP 含量的测定

取血浆2 mL，静置30 min 后，3000 r/min 离心10 min，取上层血清，4℃保存待测。 按酶联免疫检测试剂盒使用说明书操作，即在96 孔板中加入准备好的样品和对照品，生物素标记二抗和酶标试剂，37℃反应60 min，洗板5 次，加入显色液A、B，37℃显色10 min，加入终止液。 在酶标仪450 nm 波长下读测量各孔的吸光度并计算。

1.8 统计学方法

采用SPSS 10.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力比较

正常组、模型组、天麻普通粉组和天麻最细粉组大鼠的逃避潜伏期分别为（14.5±1.1）、（37.4±3.3）、（29.8±3.3）和（23.6±2.2）s。 与正常组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长（P ＜0.01）。与模型组比较，天麻普通粉组和天麻最细粉组大鼠的逃避潜伏期明显缩短（P ＜0.05），且天麻最细粉组对大鼠学习记忆能力的改善作用优于天麻普通粉组（P ＜0.05）。 见图2。

2.2 各组大鼠脑组织神经递质含量比较

图2 各组大鼠逃避潜伏期比较

模型组大鼠脑组织DA、NE、5-HT 含量均显著低于正常组大鼠（P ＜0.01）；经治疗后，天麻普通粉组和天麻最细粉组的DA、NE、5-HT 含量均有所增加，且天麻最细粉组的改善作用优于天麻普通粉组（P ＜0.05）。 见表1。

表1 各组PD 大鼠脑组织内多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺含量比较（ng/g，±s）

表1 各组PD 大鼠脑组织内多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺含量比较（ng/g，±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，aP ＜0.05；与天麻普通粉组比较，bP ＜0.05；DA：多巴胺；NE：去甲肾上腺素；5-HT：5-羟色胺

组别 只数 DA NE 5-HT正常组模型组天麻普通粉组天麻最细粉组10 10 10 10 413.3±22.3 278.8±18.9*345.2±12.9a 388.9±15.8ab 345.6±14.8 237.9±12.1*266.8±14.7a 298.8±17.5ab 223.6±11.7 138.7±9.5*162.3±12.0a 189.9±14.5ab

2.3 各组大鼠血清中cAMP 和cGMP 含量比较

较之正常组，模型组cAMP 显著下降，cGMP 显著升高，cAMP/cGMP 值显著降低（P ＜0.01）。 经过天麻普通粉和最细粉的3 周治疗后， 较之PD 模型大鼠，大鼠血清中的cAMP 显著上升（P ＜0.05），cGMP 显著降低（P ＜0.05），进而二者的比值显著升高（P ＜0.05），趋于正常，而且天麻最细粉的疗效明显优于天麻普通粉（P ＜0.05）。 见表2。

表2 各组PD 大鼠脑血清中的环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷含量及环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷比较（±s）

表2 各组PD 大鼠脑血清中的环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷含量及环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷比较（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.01；与模型组比较，aP ＜0.05；与天麻普通粉组比较，bP ＜0.05；cAMP：环磷酸腺苷；cGMP：环磷酸鸟苷

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3 讨论

PD 多发于中老年人，男性略多于女性，是中老年人致残的主要原因之一。 其发病机制迄今尚不十分清楚，可能与环境因素、免疫学异常、线粒体功能障碍和氧化应激过度、年龄老化、细胞凋亡等诸多因素有关，是多种机制协同作用的结果。 随着人口老龄化的加剧和人们生活节奏的增快，以PD 为代表的中枢神经退行性疾病已经成为仅次于心血管疾病、恶性肿瘤以及中风之后的主要致死性疾病，该病的治疗是神经内科面临的世界性难题。

目前尚无治疗PD 的特效药物，常用西药只能控制症状，以左旋多巴为代表的药物替代疗法仍是西医治疗帕金森病的金标准，但是随着用药时间的延长和用量的加大，毒副作用也越来越大，严重影响患者的生活质量。 中医中药以其毒副作用小、协同作用强和整体调节等优势，为PD 的中药防治提供了良好前景。现代药理学研究亦表明，在保护神经细胞、抑制氧化应激、抗兴奋性毒性、抑制细胞凋亡等方面，中医药的作用明显。 进一步深入挖掘中医中药的潜力，对于提高PD 患者的生存质量意义重大[8]。 有多种中药复方、单味药、有效部位及单体均可在动物模型上对PD有防治作用，其主要机制涉及保护黑质细胞、改善神经递质含量、抗氧化和调节免疫、提高化疗疗效、减轻毒副作用等，并可能延缓疾病进程。 尤其是中药复方通过多种有效成分对人体有多环节、多层次、多靶点的整合调节作用，可能对PD 神经保护治疗有一定的优势[9]。

天麻为兰科天麻属植物天麻（Gastrodia elata）的干燥块茎，又名赤箭、定风草、独摇兰，为我国传统名贵中药，主治头昏、眩晕、肢体麻木、抽搐、中风等中枢神经系统疾病，被《神农本草经》列为上品。 从天麻干燥块茎中提取出的化学成份主要有酚类、有机酸类及植物中常见的甾醇等，其中活性成分含量最高的有效单体成分是天麻素，又称天麻苷，常作为衡量天麻药材和制剂质量的指标成分。 现代医学已经证实，天麻具有抗惊厥、镇静、镇痛及抗感染等作用，并对大脑的学习和保护功能也有不同程度的作用[10]。 实验证实，天麻对PD 模型大鼠具有DA 神经元保护作用，能够改善PD 大鼠的运动功能，恢复纹状体的DA 含量，减缓PD 病程的进展[11-13]。 作为常用中药，天麻经常出现在中医治疗PD 的方药之中[14]。

采用超微粉碎的方式可以将中药粉碎成最细粉。由于超微粉碎减少了细胞壁的屏障作用，因而比表面积大幅提高，改善了口感，减少了药材用量，可以大幅提高细胞内有效成分的释放速度及释放量，显著提高中药的生物利用度[15]。 在前期的研究中，笔者发现天麻经过超微粉碎后，随着粒径的减小（D50由157.10 μm减小到27.44 μm），中药粉体的比表面积显著增加（由0.403 m2/g 增加到0.626 m2/g），中药粉体的醇溶性浸出物和有效成分的提取效率也显著改善，天麻醇溶性浸出物的量由普通粉的10.83%提高到最细粉的12.23%，天麻有效成分（天麻素）的量由普通粉的0.31%提高到最细粉的0.43%[16]。 在随后的常温留样实验考察中，比较了不同时间的天麻最细粉的形貌结构、粒径、比表面积、堆密度、休止角等粉体学特征以及有效成分（天麻素）的量和体外溶出曲线的变化，发现经过12 个月的常温留样实验，天麻最细粉的粉体学特征没有发生显著性改变，有效成分（天麻素）的量基本保持不变，体外溶出曲线的差异性很小，具有等价性，表明天麻制成最细粉后，质量稳定性良好，可以保证临床用药的安全[17]。 动物实验研究亦肯定了天麻在制成最细粉后，药理效应显著增强[3]。

PD 动物模型的制作是PD 研究的基础和关键。在众多的模型中，6-OHDA 大鼠模型和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）灵长类模型的病理改变以及行为学表现与人类PD 表现相类似，成为目前最常用最经典的PD 动物模型，对研究PD 主要病理机制和治疗药物起着重要作用[18]。 在之前研究[3]的基础上，笔者继续采用经典的6-OHDA 损毁注射法制作PD 大鼠模型，天麻普通粉和最细粉分别给药3 周后，用Morris 水迷宫测试天麻对PD 模型大鼠学习记忆能力的影响；采用高效液相色谱-电化学检测法检测脑内DA、NE 和5-HT 神经递质的含量；采用酶联免疫法测定经过天麻普通粉和最细粉治疗后，PD 模型大鼠血清中cAMP、cGMP 及cAMP/cGMP 比值的变化。 实验结果表明，在改善PD 大鼠的学习记忆能力、提高PD 大鼠脑组织神经递质的水平、调节血清中cAMP/cGMP 的平衡方面，天麻具有确实的功效，而且天麻最细粉的效果要优于普通粉，再次为天麻最细粉的临床使用提供了科学依据。

[1] 孙作厘，贾军，虞芬，等.帕金森病基底神经节神经递质失衡的研究进展[J].生理科学进展，2011，42（6）：427-430.

[2] 卢晓喆，黄延焱.帕金森病的治疗[J].中华老年心脑血管病杂志，2014，16（9）：1007-1008.

[3] 陈慧，艾国，黄正明.天麻最细粉和普通粉对帕金森病大鼠神经行为学、氧化应激反应和神经炎症反应的对比研究[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（3）：144-148.

[4] 陈敏，余江平，黄敏.环核苷酸的生理作用及临床应用[J].中国药房，2007，18（11）：872-874.

[5] 包新民，舒思云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京：人民卫生出版社，1991：53.

[6] Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat [J]. NeurosciMethods，1984，11（1）：47-64.

[7] 陆征宇，赵虹，汪涛，等.补肾养肝熄风汤对帕金森病小鼠纹状体神经递质和多巴胺受体的影响[J].中医杂志，2011，52（14）：1217-1220.

[8] 李强，霍青.中医中药治疗帕金森病前景展望[J].中医临床研究，2013，5（24）：117-119.

[9] 吴斌，赵书志，王修敏，等.中医药对帕金森病动物模型的治疗机制[J].中国中药杂志，2011，36（18）：2588-2591.

[10] 陶云海.天麻药理研究新进展[J].中国中药杂志，2008，33（1）：108-110.

[11] 袁红，张振文，梁立武，等.天麻对帕金森病模型鼠肿瘤坏死因子α 及胶质源性神经营养因子表达的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2010，12（1）：69-72.

[12] 刘平，黄丽红，袁红，等.天麻对帕金森病大鼠黑质凋亡细胞表达及酪氨酸羟化酶阳性神经元的影响[J].国际免疫学杂志，2011，34（2）：147-151.

[13] 冯为菊，李玉梅，张小莉，等.天麻素对帕金森病合并轻度认知功能损害患者的疗效[J].实用医学杂志，2011，27（10）：1866-1868.

[14] 魏维，蔡晶.帕金森病的中医证型分布及中医药治疗方药文献分析[J].中医杂志，2013，54（20）：1778-1782.

[15] 孙建国，易延逵，蔡光先，等.中药超微粉碎技术研究及应用的现状和思考[J].湖南中医杂志，2010，26（6）：115-118.

[16] 化玮，刘洋，艾国，等.3 种中药最细粉的制备及理化性质考察[J].中草药，2013，44（23）：3296-3302.

[17] 陈菲，艾国，盛柳青，等.浙贝母、天麻和红景天最细粉的稳定性研究[J].中草药，2014，45（23）：3397-3401.

[18] 张健，徐阿晶.帕金森病动物模型研究进展[J].药学服务与研究，2012，12（5）：382-386.