阿魏菇多糖聚酰胺层析脱色工艺及其抑菌活性

张伟丰，王 亮*，陈义勇

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830066；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500)

阿魏菇多糖聚酰胺层析脱色工艺及其抑菌活性

张伟丰1，王 亮1*，陈义勇2

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830066；2.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500)

[目的]探讨阿魏菇多糖的聚酰胺层析脱色工艺及其抑菌活性。[方法]以新疆阿魏菇为原料，采用水浴浸提法提取阿魏菇多糖，以蛋白脱除率、多糖保留率和脱色率为指标，探讨聚酰胺用量、去离子水用量以及洗脱速度对阿魏菇多糖脱色的影响，并研究阿魏菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和酿酒酵母的抑菌活性。[结果]聚酰胺层析法为阿魏菇多糖最佳的脱蛋白方法，其脱色最佳工艺条件为：聚酰胺用量为60 g(粗多糖的3000倍)，聚酰胺柱用1.5倍柱体积的去离子水以1.5 ml/min的流速进行洗脱，在此工艺条件下，蛋白质脱除率达到93.6%。阿魏菇多糖对黑曲霉和酿酒酵母没有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，最小抑菌浓度分别为3.125、6.250和3.125 mg/ml，且抑菌活性与多糖质量浓度呈正相关关系。[结论]聚酰胺层析工艺可用于阿魏菇多糖的脱色。

阿魏菇多糖；聚酰胺层析；脱色；抑菌

阿魏菇(Pleurotusferulae)又名阿魏侧耳、阿魏蘑，因其生长在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子实体具有很高的营养价值和药用价值[1]。研究发现阿魏菇多糖具有增强免疫力[2]、抗炎[3]等功效。目前关于阿魏菇多糖的提取大多采用水浴醇沉法[4-5]，多糖提取物中含有较多的杂质如蛋白质和色素，阿魏菇多糖的纯化是其精制过程中非常重要的一步，是研究其理化性质、生物活性和化学结构的基础。

为了获得纯度较高的阿魏菇多糖，笔者以新疆阿魏菇为原料，探讨阿魏菇多糖的聚酰胺层析脱色工艺，另外关于阿魏菇多糖的抑菌活性研究尚未见报道，所以笔者在阿魏菇多糖纯化的基础上，进一步探讨了其抑菌活性，旨在为开发阿魏菇多糖这一天然防腐剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂阿魏菇(购自乌鲁木齐南山)，经新疆大学生命科学与技术学院微生物教研室鉴定为阿魏菇子实体。粉末活性炭(成都科龙试剂公司)；树脂S-8(天津南开大学化工厂)；聚酰胺(中国医药集团上海化学试剂公司)；葡萄糖、苯酚、氯仿、正丁醇、三氯乙酸、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、95%乙醇等均为分析纯。大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黑曲霉(Aspergillusniger)由常熟理工学院微生物实验室提供。细菌培养基、酵母培养基(YPD培养基)和霉菌马铃薯培养基(PDA培养基)参照文献[6]配制。

1.2 主要仪器RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司)；DJ-04粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)；752型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；LD4-ZA型离心机(北京医用离心机厂)；SHB-B循环水式真空泵(郑州长城科工贸公司)；LGJ-10冷冻干燥仪(南京百思威科技有限公司)；UV2102 PCS紫外扫描仪(上海精密仪器有限公司)；DHP-90不锈钢胆电热恒温培养箱(上海索普机械有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1阿魏菇粉的制备。新鲜阿魏菇在50 ℃条件下真空干燥后粉碎，过80目筛，得到预处理的阿魏菇粉。

1.3.2阿魏菇多糖的提取。称取阿魏菇粉5 g，放入250 ml的三角瓶中，加入200 ml水，在80 ℃条件下提取3 h，然后冷却，将提取液离心(4 000 r/min，15 min)，弃去沉淀，将上清液减压浓缩，按体积比1∶4加入95%乙醇，4℃条件下过夜，弃去上层液体，将沉淀冷冻干燥得到阿魏菇多糖。

1.3.3多糖含量测定。采用苯酚-硫酸法[7]。

1.3.4蛋白质含量测定。采用福林-酚法[8]。

1.3.5阿魏菇多糖脱蛋白方法。

1.3.5.1三氯乙酸法。称取20 mg阿魏菇多糖，加入蒸馏水配制成10%的多糖溶液，然后向多糖溶液加入三氯醋酸(3%)，直至溶液不再继续浑浊为止，4 ℃条件下放置过夜，然后离心(1 000 r/min，15 min)，弃去沉淀，测定上清液中的蛋白质和多糖含量，根据下列公式计算多糖保留率和蛋白质脱除率。

(1)

(2)

1.3.5.2Sevage法。 称取20 mg阿魏菇多糖，加入蒸馏水配制成10%的多糖溶液，按照阿魏菇多糖溶液的1/4体积加入Sevage试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1)，在25 ℃下混合振荡40 min，然后离心(1 000 r/min，15 min)去沉淀，将上清液再按上述比例加入Sevage试剂，重复操作5次，测定上清液中的蛋白质含量和多糖含量，根据公式(1)和(2)计算多糖保留率和蛋白质脱除率。

1.3.5.3聚酰胺层析法。称取80 g聚酰胺，倒入一定量的去离子水加热20 min，然后装层析柱(4 cm×58 cm)，最后用去离子水洗脱平衡。称取20 mg阿魏菇多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，将多糖溶液上柱，用去离子水洗脱，测定洗脱液中的蛋白质含量和多糖含量，根据公式(1)和(2)计算多糖保留率和蛋白质的脱除率。

1.3.6阿魏菇多糖聚酰胺层析脱色条件的优化。

1.3.6.1聚酰胺用量对脱色效果的影响。 称取20 mg阿魏菇多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，然后分别将20、40、60、80、100 g的聚酰胺倒入一定量的去离子水中加热20 min，分别装层析柱(4 cm×58 cm)，去离子水洗脱平衡。分别将多糖溶液加入聚酰胺层析柱中进行吸附，1倍柱体积的去离子水以1.0 ml/min的流速进行洗脱，359 nm处测定多糖原液和洗脱液吸光值，计算脱色率，根据公式(3)计算脱色率[9-10]，苯酚-硫酸法检测多糖，根据公式(1)计算多糖保留率，探讨聚酰胺用量对脱色效果的影响。

(3)

1.3.6.2去离子水用量对脱色效果的影响。称取20 mg阿魏菇多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到80 g的聚酰胺柱(40 cm×580 mm)中进行吸附，用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍柱体积的去离子水以1.0 ml/min的流速进行洗脱，分别计算脱色率和多糖保留率，探讨去离子水用量对脱色效果的影响。

1.3.6.3洗脱速度对脱色效果的影响。称取20 mg阿魏菇多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到80 g的聚酰胺柱(40 cm×580 mm)中进行吸附，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml/min的流速进行洗脱，分别计算脱色率和多糖保留率，探讨洗脱速度对脱色效果的影响。

1.3.7紫外光谱检测。称取20 mg阿魏菇多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，在聚酰胺层析脱色最佳条件下，将阿魏菇多糖溶液上聚酰胺色谱柱，蒸馏水进行洗脱，紫外光谱对洗脱液进行扫描(波长范围：190～800 nm)，探讨聚酰胺层析对阿魏菇多糖蛋白质的去除效果，根据公式(2)计算蛋白质脱除率。

1.3.8阿魏菇多糖的抑菌活性。

1.3.8.1菌种活化与菌悬液制备[11]。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌接种到细菌培养基中，置于37 ℃恒温振荡培养24 h；将黑曲霉和酿酒酵母分别接种到PDA培养基和YPD培养基中，28 ℃下培养48 h，长出菌落后，分别挑取活化后的菌种放入9 ml无菌生理盐水中，振荡摇匀制备菌悬液，浓度约为107CFU/ml备用。

1.3.8.2抑菌试验。用无菌水配制成质量浓度为100 mg/ml的阿魏菇多糖溶液。分别稀释成50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/ml系列质量浓度溶液。取供试菌悬液0.1 ml(浓度约为107CFU/ml)置于倒好培养基的培养皿中，放入牛津杯，向牛津杯中加入不同质量浓度的多糖溶液150 μl，每个质量浓度3次重复，同时用无菌水作对照。细菌于37℃培养48 h，真菌于28 ℃培养72 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径，出现抑菌圈所对应的阿魏菇多糖浓度即为最小抑菌圈浓度。

2 结果与分析

2.1 阿魏菇多糖脱蛋白方法选择三氯乙酸法、Sevage法和聚酰胺吸附柱层析法对阿魏菇多糖中的蛋白脱除效果见图1。从图1可以看出，三氯乙酸法蛋白脱除率和多糖保留率都较低，易引起多糖的降解。Sevage法脱除蛋白次数较多(6次)，导致多糖损失较多，聚酰胺吸附柱层析法具有较好的脱除蛋白效果，蛋白脱除率达90.8%，且对多糖影响较小，多糖保留率较高，达到88.6%，所以选择聚酰胺吸附柱层析法作为阿魏菇多糖脱蛋白的方法。

2.2 阿魏菇多糖的脱色

2.2.1聚酰胺用量对脱色效果的影响。聚酰胺用量对阿魏菇多糖脱色效果的影响见图2。从图2可以看出，随着聚酰胺用量的增加，脱色率逐步增大，多糖的保留率逐渐下降，当聚酰胺用量超过60 g，多糖脱色率变化不大，但多糖的保留率有较大下降，为了尽可能多地保留多糖，节约处理费用，确定聚酰胺用量为60 g(粗多糖的3 000倍)。

2.2.2去离子水用量对脱色效果的影响。去离子水用量对脱色效果的影响见图3。从图3可以看出，随着洗脱体积的增加，阿魏菇多糖脱色率逐步下降，但多糖保留率逐渐增加，当洗脱体积达到1.5倍柱体积时，其脱色率达到51.2%，多糖保留率为88.2%，洗脱体积大于1.5倍柱体积时，多糖保留率变化不大，因此选用1.5倍柱体积的去离子水进行洗脱。

2.2.3洗脱速度对脱色效果的影响。洗脱速度对脱色效果的影响见图4。从图4可以看出，洗脱速度对脱色率没有明显影响，但随着洗脱速度的增大，多糖的保留率逐渐减小，当洗脱速度大于1.5 ml/min时，多糖的保留率变化不大。由于洗脱速度越小，耗时越长，所以选择的洗脱速度为1.5 ml/min。

2.3 紫外光谱分析阿魏菇多糖脱蛋白前后的紫外光谱分别见图5和图6。从图5和图6可以看出，阿魏菇粗多糖在280 nm处有一个较为明显的吸收峰，经过聚酰胺色谱柱处理之后，这个峰消失，经福林-酚法[7]测定后，蛋白质脱除率达到93.6%。

2.4 阿魏菇多糖的抑菌活性阿魏菇多糖的抑菌效果见表1。从表1可以看出，阿魏菇多糖对黑曲霉和酿酒酵母没有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性与多糖质量浓度呈正相关关系，其中对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，对大肠杆菌的抑制作用最弱。阿魏菇多糖对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为3.125 mg/ml，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为6.250 mg/ml。

3 结论

(1)该研究确定聚酰胺吸附柱层析法作为阿魏菇多糖脱蛋白的最佳方法。

(2)聚酰胺柱层析对阿魏菇多糖脱色的最佳工艺条件：聚酰胺用量为粗多糖的3 000倍，聚酰胺柱用1.5倍柱体积的去离子水以1.5 ml/min的流速进行洗脱，在此工艺条件下，蛋白质脱除率达到93.6%。

(3)阿魏菇多糖对黑曲霉和酿酒酵母没有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性与多糖质量浓度呈正相关关系，其中对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，对大肠杆菌的抑制作用最弱。阿魏菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为3.125、6.250和3.125 mg/ml。

表1 阿魏菇多糖对各菌种的抑菌效果 mm

注：数据为抑菌圈直径，数值为3次试验的平均值，“-”表示未显示抑菌活性。

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Decolorization Technology of Polysaccharides fromPleurotusferulaeby Polyamide Chromatography and Its Antibacterial Activity

ZHANG Wei-feng1, WANG Liang1*, CHEN Yi-yong2(1. School of Life Science and Technology, Xinjiang University,Urumqi, Xinjiang 830046;2.School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology,Changshu, Jiangsu 215500)

[Objective] To investigate decolorization technology of polysaccharides fromPleurotusferulaeby polyamide chromatography and its antibacterial activity. [Method]Pleurotusferulaefrom Xinjiang was used as raw material. Polysaccharides fromPleurotusferulaewere extracted with water. Deprotein rate, polysaccharide retention rate and decoloration rate were used as the index. Effect of content of polyamide, deionized water and flow rate on decolorization of polysaccharides fromPleurotusferulaeby polyamide chromatography was investigated. Antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae was also investigated. [Result] Polyamide chromatography was the best deproteinization method on polysaccharides fromPleurotusferulae. The optimum decolorization technology was as follows: The content of polyamide was 60 g, and the polyamide column was eluted with 1.5 column volumes of deionized water at flow rate of 1.5 ml/min. Under this technology, the deprotein rate was 93.6%. Polysaccharides fromPleurotusferulaehad no antimicrobial activity of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae and had antibacterial activities against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus subtilis with minimum inhibitory concentration of 3.125, 6.250 and 3.125 mg/ml, respectively. The antibacterial activity was positively correlated with polysaccharides concentration. [Conclusion] Polyamide chromatography can be used for decolorization of polysaccharides fromPleurotusferulae.

Polysaccharides fromPleurotusferulae; Polyamide chromatography; Decolorization; Antibacterial

2013年新疆维吾尔自治区科技支疆项目计划(指令性)项目(2013911071)。

张伟丰(1988- )，男，河南郑州人，硕士研究生，研究方向：食品加工。*通讯作者，副教授，硕士生导师，从事食品加工方面的研究。

2015-03-30

S 188

A

0517-6611(2015)14-033-03