口腔扁平苔藓角质形成细胞与淋巴细胞的混合培养

许　斌，陈　纯　（江苏省无锡市中医医院口腔科，江苏无锡214000）

口腔扁平苔藓角质形成细胞与淋巴细胞的混合培养

许斌，陈纯（江苏省无锡市中医医院口腔科，江苏无锡214000）

近年来对口腔扁平苔藓（OLP）的研究越来越多，OLP的组织病理学表明角质形成细胞和淋巴细胞与其发病有着重要关系，很多学者开始建立这两种细胞的体外培养模型，寻找OLP的发病机制，本研究就最近几年的研究状况作以简要概括，并对OLP的细胞培养模型提出一些研究设想．

口腔扁平苔藓；角质形成细胞；淋巴细胞；混合培养

0　引言

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是发生于口腔黏膜的一种慢性炎症性疾病，其发病率为0．1%～4%［1］，其病因和发病机制目前尚不清楚，但是有研究表明OLP是一种T细胞介导的自身免疫性疾病［2］，其中以T淋巴细胞活化为主的细胞免疫失调是口腔发生病变的关键环节［3］．但具体机制仍然不明确，使得OLP缺乏有效的治疗方法，为此很多学者开始体外培养OLP相关细胞，模拟机体局部OLP的发病环境，探寻OLP的发病机制，寻求有效治疗方法．

1　细胞培养

1．1角质形成细胞的培养角质形成细胞的培养方法目前主要有：组织块培养法、以3T3细胞为滋养层的培养法、以胶原为滋养层的培养法、气⁃液交界面培养法、无血清培养法［4］．

张兴洪等［5］证实了胰酶加dispase酶消化、限制性KC⁃FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法．有学者比较了酶化法和直接分离法获得口腔黏膜角质形成细胞的效果，结果显示酶催化法在获得角质形成细胞所用的时间、细胞的数量以及细胞在体外的生存时间方面要优于直接法［6］．

1．2淋巴细胞的培养从外周血分离单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs）纯化培养T淋巴细胞常用的方法有：尼龙毛吸附法、补体细胞毒法、免疫磁珠法．前两种方法得到的T淋巴细胞纯度低且含有自然杀伤（natural killer，NK）细胞，后一种方法得到的T淋巴细胞纯度高但是费用昂贵［7］．

李付广等［8］根据不同细胞在特定培养基中的死亡时间不同而筛选出T淋巴细胞，该实验在低剂量IL⁃2的维持条件下利用细胞培养淘汰法获得了初步纯化的T淋巴细胞，该方法经济、操作简单．

1．3角质形成细胞与淋巴细胞的混合培养目前关于OLP的角质形成细胞与淋巴细胞的体外共培养模型的建立尚且不多．李琴等［9］成功建立了OLP角质形成细胞与淋巴细胞的体外混合培养模型，一定程度上模拟了人体局部OLP的发病环境．国外有学者从OLP患者口腔粘膜切取部分组织，分离得到角质形成细胞后在无血清的培养基中进行培养，从正常人外周血中分离得到单个核细胞，悬浮在含有L⁃谷氨酸和抗生素的RPMI⁃1640培养基中，再将单个核细胞在角质形成细胞的培养基中培养，实验结果显示角质形成细胞表达的TNF⁃α、GMCSF、IL⁃1β等细胞因子可以诱导单个核细胞表达更多的细胞粘附分子，从而增强外周血单个核细胞的增殖、迁移［10］．

2　对OLP细胞培养的讨论

近年来对于OLP角质形成细胞、淋巴细胞培养的研究尚且不多，其中存在一些值得讨论的问题．

2．1不同培养基对培养结果的影响OLP的细胞培养大部分采用含10%胎牛血清的1640培养基．不过最近有学者分别用RPMI⁃1640培养基和IMDM培养基培养外周血树突状细胞（dentritic cell，DC），观察不同培养基对细胞功能的影响，实验结果显示两种细胞培养基培养的DC在形态学、CD14和CD83的表达以及内吞作用方面没有太大的差异，但是用IMDM培养的DC低表达CD1a、IL⁃12，高表达IL⁃6、IL⁃8、IL⁃10，减少了对T细胞增殖的刺激作用，用IMDM培养基培养的DC可能与诱导机体的免疫耐受有关［11］．

以上说明用RPMI⁃1640和IMDM培养细胞可以使同样的细胞表现出不同的功能，目前IMDM有多种型号，如果采用不同型号的IMDM培养基在体外混合培养OLP角质形成细胞和淋巴细胞，结果是否会发生改变还需要进一步地研究．

2．2培养基中离子及其浓度的改变对培养结果的影响李习玲等［12］采用无血清无钙离子的角质形成细胞生长培养基，不加任何细胞因子和生长因子，仅仅通过改变培养基中的钙离子浓度，调节角质形成细胞的形成和分化，成功的对小鼠的表皮角质形成细胞进行了原代培养．

Takagi等［13］在培养应用于临床再生医学的角质形成细胞时发现，去掉传统角质形成细胞培养基中的转铁蛋白和金属元素硒，对犬科口腔黏膜上皮细胞层的形成没有明显影响．

2．3PFT⁃α对培养结果的影响张兴洪等［14］取正常皮肤的角质形成细胞进行体外培养，证实一定剂量的P53抑制剂PFT⁃α可以减轻阿霉素对人皮肤角质形成细胞的损伤．口腔黏膜角质形成细胞培养的有关实验证实只有小而圆的细胞才具有增殖能力［24］，如果在培养液中加入P53抑制剂PFT⁃α，会不会对角质形成细胞的培养结果产生影响需要通过实验证实．

综上所述，OLP是发生于口腔黏膜的慢性炎症，作为一种T细胞介导的自身免疫性疾病［15］，OLP的发生发展与多种细胞因子密切相关．本研究对与OLP关系密切的主要细胞因子做了简要概括，鉴于OLP与多种细胞因子有关，有些学者开始体外混合培养OLP角质形成细胞与淋巴细胞，但是目前相关的研究尚且不多，OLP的发病机制以及很多问题都有待进一步研究证实．

［1］Hirota SK，Moreno RA，Dos SC，et al．Analysis of a possible

association between oral lichen planusand drug intake．A controlled

study［J］．Med Oral PatolOral Cir Bucal，2011，16（6）：e750－e756．

［2］唐国瑶，周曾同．口腔黏膜病临床治疗Ⅳ．口腔扁平苔藓的诊断

及治疗进展［J］．中华口腔医学杂志，2006，41（11）：697－699．

［3］Zhong X，Tumang JR，Gao W，et al．PD⁃L2 expression extends beyond dendritic cells／macrophages to B1 cells enriched for V（H）11／V（H）12 and phosphatidylcholine binding［J］．Eur J Immunol，2007，37（9）：2405－2410．

［4］黄几平．角质形成细胞的分离培养和临床应用［J］．国外医学：生物医学工程分册，2005，28（3）：164－167．

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［8］李付广，李沛，靳静，等．外周血T淋巴细胞的培养、纯化及鉴定［J］．郑州大学学报：医学版，2006，41（4）：605－607．

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［11］Chen C，Liu YL，Liang XL，et al．Effect of different culturemediums on the development ofmonocyte⁃derived dentritic cells［J］．Zhong⁃guo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2011，19（4）：1010－1014．

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［13］Takagi R，Yamato M，Murakami D，et al．Preparation of keratinocyte culture mediumfor theclinical applications of regenerative medicine［J］．JTissue Eng Regen Med，2011，5（4）：e63－e73．

［14］张兴洪，刘彦群，魏志平，等．p53抑制剂PFT⁃α对阿霉素诱导的人皮肤角质形成细胞凋亡的影响［J］．中国皮肤性病学杂志，2011，25（5）：344－345，354．

［15］黄慧，姚本栈，汤惠忠．大鼠口腔黏膜角质形成细胞体外连续培养的研究［J］．口腔医学，2007，27（8）：401－403．

R781．5

A

2095⁃6894（2015）08⁃117⁃02

2015－07－24；接受日期：2015－08－06

许斌．硕士．E⁃mail：xubin188＠126．com