复合益生菌与金霉素配伍抑制金黄色葡萄球菌生长的研究

■王二柱 朱 群 郭红伟 常 娟 尹清强

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002；2.驻马店华中正大有限公司，河南驻马店 463000）

随着人们对畜产品安全生产重视度不断的提高，以及抗药和耐药型超级病菌的出现，许多国家已经明文规定抗生素类添加剂的适用动物品种、适用阶段、剂量、停药期等，欧盟已于2006年禁止所有抗生素作为饲料添加剂在动物生产中应用。为了寻找抗生素的替代品，研究人员已开发出了微生态制剂、酶制剂、寡聚糖、酸化剂、中草药等产品[1-2]，但在生产实践中抗生素的应用仍然十分广泛，为了达到较好的抑菌和促生产效果，甚至大剂量地使用抗生素，导致抗生素的滥用。为了降低抗生素的使用剂量，将抗生素替代品如微生态制剂等与抗生素配伍使用，以期获得良好的抑菌和促生产效果。试验通过体外试验，研究了金霉素与四种益生菌配伍对致病性金黄色葡萄球菌生长的抑制作用，探讨金霉素与微生态制剂的最佳配伍比例，旨在为金霉素与微生态制剂同时应用于实际生产提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 金霉素与微生物

金霉素由驻马店华中正大有限公司提供，其标准溶液的配制方法如下：样品置于干燥器中干燥12 h后，准确称取3 g样品(精确到0.000 2 g)加0.1 mol/l盐酸30 ml搅拌5 h后定容至50 ml，在无菌条件下用0.2 μm滤膜过滤，配制成9 000 U/ml的无菌金霉素溶液，然后通过不同梯度的稀释，制备金霉素含量分别为75、150、200、300、400、500、600 mg/kg的标准溶液。益生菌(枯草芽孢杆菌、布拉迪酵母、乳酪杆菌、粪肠球菌)和金黄色葡萄球菌均由河南农业大学动物营养与生物技术实验室保存。

1.2 培养基

1.2.1 培养金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的LB培养基

胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，用蒸馏水定容至1 L，pH值为7.0～7.2，在0.15 MPa高压下蒸汽灭菌20 min。冷却后按1%的接种量接种，37℃振荡（150 r/min）培养48 h。

1.2.2 金黄色葡萄球菌鉴别培养基——抗生素Ⅱ号培养基

蛋白胨6 g、葡萄糖1 g、牛肉膏粉1.5 g、酵母浸粉6 g、琼脂 12～15 g，定容至 1 L，pH 值为 6.5～6.6，在0.15 MPa高压下蒸汽灭菌20 min。

1.2.3 培养乳酪杆菌的MRS培养基

胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、吐温80 1 ml、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、柠檬酸钠2 g、硫酸镁200 mg、硫酸锰50 mg，用蒸馏水定容至1 L，pH值为6.2～6.6，在0.15 MPa高压下蒸汽灭菌20 min。接种乳酸杆菌后，37℃静止培养48 h。

1.2.4 培养酵母菌的YPD培养基

酵母浸提物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、用蒸馏水定容至1 L，pH值为7.0～7.2，在0.15 MPa高压下蒸汽灭菌20 min。接种酵母菌后，30℃振荡（150 r/min）培养48 h。

1.3 试验方法

1.3.1 复合益生菌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

采用四因素四水平的正交试验设计，先将单独益生菌培养液用培养基稀释至活菌数为1×108个/ml，然后按表1的体积比配制成复合益生菌制剂。将金黄色葡萄球菌的培养液均匀地涂布在已加入抗生素Ⅱ号培养基的双碟培养皿中，待其完全吸收后，放入牛津杯，向牛津杯中加入100 μl复合益生菌菌液，放于4℃吸收4 h，然后于37℃恒温培养箱中培养24 h，每个处理3个重复，用游标卡尺测定抑菌圈直径。

1.3.2 复合益生菌与金霉素配伍对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

由上一步试验选出的复合益生菌最优组合，与一定量的金霉素混合，配制成含不同金霉素浓度的复合益生菌制剂。另外，以不同浓度的单一金霉素作为对照组，按1.3.1的试验方法测定抑菌圈直径。

1.4 统计分析

试验数据均以“平均值±标准差(mean±SD)”表示，采用SAS 6.12统计软件对所有数据进行显著性检验，以P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 复合益生菌对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用(见表1)

表1 复合益生菌组合对金黄色葡萄球菌的抑制效果

由表1可知，枯草芽孢杆菌的最大k值为k4，酵母菌的最大k值为k1，乳酪杆菌的最大k值为k4，粪肠球菌的最大k值为k1，这表明复合益生菌抑制金黄色葡萄球菌的最佳配比为：枯草芽孢杆菌∶酵母菌∶乳酪杆菌∶粪肠球菌=4∶1∶4∶1（P＜0.05）。其R值的大小依次为：RC＞RA＞RD＞RB，即乳酪杆菌＞枯草芽孢杆菌＞粪肠球菌＞酵母菌,这表明复合益生菌中乳酪杆菌所占比例的变化对抑制金黄色葡萄球菌的影响最大，其次分别是枯草芽孢杆菌、酵母菌和粪肠球菌。

2.2 复合益生菌与金霉素配伍对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用(见表2)

表2 复合益生菌与金霉素配伍对金黄色葡萄球菌的抑制效果

由表2可知，随着金霉素浓度的提高，无论是单一金霉素还是金霉素与复合益生菌的配伍，其抑菌效果均表现出逐渐增强的趋势。单独复合益生菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用与200～300 mg/kg的金霉素抑制作用相当。当150 mg/kg金霉素与复合益生菌配合后，其抑菌效果与单独400～500 mg/kg金霉素作用相当；而当200～300 mg/kg金霉素与复合益生菌配合后，其抑菌效果要优于单独600 mg/kg金霉素的作用。即低浓度金霉素与复合益生菌配合后，可以达到高浓度金霉素的抑菌效果。

3 讨论

3.1 复合益生菌抑制金黄色葡萄球菌的生长

益生菌是一种活菌制剂，当其数量达到一定程度时，对宿主的健康有促进作用[3]。目前，益生菌作为一种新型添加剂广泛应用于食品行业和动物生产中[4-5]，它可以调整动物肠道的微生物菌群平衡，并产生一些抗菌性物质来抑制病原菌的生长[6]。以往的研究表明，益生菌的抑菌活力在体外可通过牛津杯法进行测定[7]，牛津杯中的抗菌物质可以透过琼脂来抑制表面病原菌的生长，抑菌圈越大，其抑菌活力越高。

本研究采用正交试验设计研究枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酪杆菌和粪肠球菌抑制金黄色葡萄球菌的生长，结果表明，乳酪杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用最大，其主要原因是乳酪杆菌能够分泌乳酸、过氧化氢、细菌素等抑菌物质[8]。本研究得出的益生菌最佳配比为：枯草芽孢杆菌∶酵母菌∶乳酪杆菌∶粪肠球菌=4∶1∶4∶1，其抑菌能力可以达到200～300 mg/kg金霉素的抑菌作用，为抗生素的替代提供了参考。

3.2 复合益生菌与金霉素配伍抑制金黄色葡萄球菌的生长

金霉素是一种广谱抗菌剂，无论对致病菌还是有益菌都有一定程度的抑制作用。本研究结果表明，当复合益生菌与75 mg/kg金霉素配伍后，其抑菌圈直径与单独复合益生菌相似。随着金霉素配伍剂量的增大，抑菌圈直径表现出逐渐增大的趋势，且大于对应剂量的单独金霉素的抑菌能力，表明复合益生菌与金霉素配伍使用具有叠加抑菌效应。白耀辉等(2011)[9]研究表明，将益生菌制剂与抗生素联合应用在规模化肉鸡生产中可以显著提高肉仔鸡的日增重和饲料转化率，改善胴体品质，这表明益生菌与抗生素配伍使用是可行的，与本研究的体外抑菌试验结果相一致。

4 结论

本研究获得了四种益生菌抑制金黄色葡萄球菌生长的最佳配伍比例为：枯草芽孢杆菌∶酵母菌∶乳酪杆菌∶粪肠球菌=4∶1∶4∶1，该复合益生菌的抑菌能力与200～300 mg/kg金霉素的抑菌能力相当。当150 mg/kg金霉素与益生菌配合后，其抑菌能力与单独400～500 mg/kg金霉素抑菌能力相当，即低浓度金霉素与复合益生菌配合后，可以达到高浓度金霉素的抑菌效果，因此可减少实际生产中抗生素的用量。