贝氏柯克斯体的分子致病机理研究进展

王 涛，宋立华

贝氏柯克斯体的分子致病机理研究进展

王 涛，宋立华

贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii，简写为Cb)是一类重要的人兽共患细胞内寄生菌，在家畜中广泛感染，感染人可导致不明发热—俗称Q热，或伴有肺炎、心内膜炎、肝炎、脊髓炎等。在我国Q热是一类被忽视的烈性传染病，误诊漏诊众多。需要警惕的是该病有突发爆发的可能。以荷兰为例，自2007至2010年，超过4 000荷兰人感染了Q热。近年来国外的Q热研究进展很快，特别是新出现的Cb无细胞培养和遗传学操作方法促进了Cb的致病机理研究，为研制新型实用的Q热防治策略提供了机遇。本文简要综述了Cb与宿主细胞间的相互作用机制，主要是脂多糖的免疫调节功能、囊泡发育机制及四型分泌系统的可能作用机理。

Q热；贝氏柯克斯体；专性胞内寄生菌；人兽共患病

贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii，简写为Cb)是Q热的病原体，经典的生物战剂，传统上被称为Q热立克次体[1]。Cb属γ变形菌纲，与军团菌属亲缘关系密切[2]。按第二版《伯杰系统细菌学手册》，Cb归军团菌目、柯克斯体科、柯克斯体属。Cb在自然界广泛分布，感染家畜如牛、羊等自然宿主主要导致流产，感染人主要导致自限性发热，伴有肺炎、心内膜炎、肝炎、脊髓炎等。人类Q热可分为急性和慢性两种临床类型，导致这两种临床型的Cb可能存在特定的基因差异。

Cb在特殊的囊泡(Coxiella-containing vacuole，简称CCV)内繁殖，有一个与衣原体类似的两相发育周期，其两种不同的结构形式，我们简称为小贝氏体(small cell variant，小细胞变异体——代谢活力弱的体外感染型)和大贝氏体(large cell variant，大细胞变异体——代谢活跃的体内增殖型)[3]。Cb嗜感染专业吞噬细胞，通过受体-配体相互作用的吞噬途径入侵单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。Cb导致的各种疾病是病原体和宿主因素的协同体现，目前对Cb致病机理的研究多集中在病原体本身的生物学机理上。

美国国立卫生研究院的Robert A. Heinzen课题组在2009年首次报道了用无生命培养基培养Cb[4]，并发展了多种Cb遗传学操作方法[5]，为研究Cb的致病机理提供了新手段。Cb遗传学操作方法及其致病机理研究也为设计新型Cb防治策略特别是研制减毒活疫苗提供了新方法新思路。本文简要综述了Cb毒力因子——脂多糖(LPS)的功能、囊泡发育机制及四型分泌系统的致病机理，以期对Cb的分子致病机制有进一步的了解和认识。

1 脂多糖是贝氏柯克斯体的重要毒力因子和保护性抗原

1956年Stoker等首次报道了在鸡胚或传代细胞中连续传代时Cb会发生相变异——由光滑的毒力型I相变为粗糙的减毒型II相[6]。CbI相与II相间的差异一般认为是由于LPS的组成与结构发生了变化，两相Cb在基因组或蛋白质水平上的差异还需要进一步研究。与经典的细菌相变异不同，Cb的相变异与基因的变异有关，是不可逆的，例如LPS合成相关基因的删除突变会产生II相[7]。LPS占I相外膜组分的75%，是重要的免疫原和保护性抗原。在遗传学方法出现之前，LPS被认为是Cb的唯一毒力因子，在调节及逃逸宿主免疫方面发挥重要功能。

1.1 贝氏柯克斯体脂多糖参与宿主免疫逃避 脂多糖O抗原掩盖了Cb表面的病原识别模式(PRP)，使Cb达到隐身的目的。I相LPS与Cb的免疫逃逸紧密相关，其掩盖PRP的功能主要体现在3个方面：1)完整的O抗原可阻止补体因子C3b的表面沉积，使I相Cb在血液中具有抗补体杀伤的能力[8]；2)I相LPS可掩盖TLR2的配体[9]，而II相LPS由于缺乏O抗原可导致Cb被TLR2识别，并激活巨噬细胞，释放IL-12和TNF；3)树突状细胞的胞内外有多种模式识别受体，而I相Cb不会诱导原代人树突状细胞的成熟，仅诱导产生低水平的IL-12和TNF[9]，说明I相LPS也掩盖了Cb的其它病原识别模式。

1.2 贝氏柯克斯体的类脂A是TLR4的拮抗剂[10]，内毒素活性低 早期研究发现I相LPS比大肠杆菌LPS的内毒素活性低了约1 000倍[11]。类脂A通常是内毒素活性的主要基团，CbLPS的低内毒素活性与Cb类脂A的4个酰基结构有关，该结构在其它细菌如鼠疫菌中可抑制TLR4通路，Cb类脂A同样也是TLR4的拮抗剂。Honstettre等认为TLR4在Cb感染时参与丝状肌动蛋白的重排，I相的自噬和炎症反应，进一步研究表明I相和II相的TLR4信号传导差异与O抗原有关[12]。转录分析却发现两相感染的宿主细胞均没有TLR4相关基因的表达[13]。很明显，CbLPS与TLR4的相互作用仍有待研究。

1.3 在小鼠巨噬细胞中LPS阻止了Cb向吞噬溶酶体的转运[14]小鼠是常用的Cb动物模型，I相可感染并致死小鼠，这与人类Q热的低致死率形成反差。有意思的是，I相和II相在人巨噬细胞上均能建立有效感染且二者没有增殖差异，但在小鼠巨噬细胞上只有I相可以有效增殖而II相在建立感染后最终会被清除掉。Barry等[14]发现II相可以激活小鼠巨噬细胞的p38α-MAPK通路，使包含II相Cb的内吞泡运送至溶酶体被分解；而I相Cb可通过LPS参与的下述功能阻止其内吞泡与溶酶体的融合：抑制TLR4、破坏p38α-MAPK通路、阻止Vps41(同型融合及蛋白分类复合物的组分)与内吞泡结合。Barry等首次在小鼠模型中阐述了LPS的分子致病机制，但也提示用小鼠模型研究Q热疫苗等需要更加仔细地分析相关实验结果。

1.4 LPS与诱导产生早期非保护性体液免疫相关 LPS是主要的细胞壁组分，但宿主感染Cb后最先产生抗外膜蛋白抗体(II相抗体)而不是抗O抗原抗体(I相抗体)，这与常见的LPS体液免疫应答不同。O抗原是Cb的重要保护性抗原，很明显CbLPS可以逃避B细胞的早期免疫监测以达到增殖和扩散的目的。在慢性Q热患者中，IL-10高表达，诱导了体液免疫的增强及高球蛋白血症，I相抗体浓度高于II相抗体，但I相抗体起不到清除性保护作用相反造成免疫损伤，这可能与IL-10抑制细胞免疫有关[15]。

1.5 LPS是公认的重要保护性抗原 灭活I相菌具有完整的LPS，可诱导良好保护性免疫应答，但由于在少数Q热康复患者中导致不良反应而不适合大范围免疫接种。国外上世纪研究的氯仿-甲醇提取组分保留了完整的LPS，不含致敏组分，是理想的Q热候选亚单位疫苗[16-17]，但该疫苗的制备工艺严重受制于特殊的培养条件和高级别生物安全的要求。LPS亚单位疫苗的一个优点是其广泛的交叉保护。Cb及其宿主在自然界的广泛分布决定了其基因组的多态性，不同分离株的LPS也有差异，但上述LPS特殊的生物学功能决定了其保守的抗原性，这与不同Cb分离株间存在广泛的交叉保护相一致。

2 贝氏柯克斯体通过挟持吞噬体通路维持在吞噬细胞酸性囊泡内的增殖

以上主要概述了LPS在维持Cb体内感染时的关键作用。在人(不是鼠)吞噬细胞微环境中，Cb通过不依赖LPS的策略逃避细胞自主性免疫(cell-autonomous immunity)，策略之一是调控形成类吞噬溶酶体的酸性繁殖囊泡。Cb与沙眼衣原体有类似之处：在囊泡(或称包涵体)内增殖，类似的发育周期，在小鼠模型上CD8+T细胞无保护作用等。但这两类菌不管在分类还是在基因组上都差异较大，衣原体通常感染上表皮细胞而Cb则主要感染吞噬细胞，Cb的生存微环境最为恶劣。Cb的囊泡(Coxiella-containing vacuole，简称CCV)具有独特的吞噬溶酶体性质，是Cb逃脱吞噬细胞内清除机制顺利进行繁殖的关键。van Schaik等较好地总结了目前对Cb囊泡内发育周期的认识[18]，简要说可分为受体吸附、吞噬、吞噬体转变、囊泡生长、菌体分裂发育共5个阶段。

2.1 受体吸附与吞噬 吞噬细胞表面的αvβ3整合素(integrin)被认为是Cb的主要受体，其配体可能是含有RGD结构域的外膜蛋白[19]。Cb通过气溶胶进入肺，与肺泡内巨噬细胞的αvβ3整合素相结合，在依赖肌动蛋白的吞噬作用下进入胞内，生成囊泡(Coxiella-containing vacuole，简称CCV)[20-21]。αvβ3整合素通常参与凋亡细胞的清除，与抑制炎症反应相关，因而Cb与αvβ3整合素的结合可能同时达到隐身的目的。另外，I相和II相均可结合αvβ3整合素，但只有I相在吞噬过程中引起明显的细胞骨架重组装，这可能与两相间的分泌差异有关。这是因为感染诱发的细胞骨架变化通常与分泌系统有关，分泌蛋白可以通过激活宿主GTPase促进吞噬作用。

除了单核细胞与巨噬细胞，非吞噬细胞如支气管上皮细胞和血管内皮细胞也是Cb的靶细胞[22]。在这类非职业吞噬细胞和休眠的单核细胞中，αvβ3整合素表达量低，不大可能是主要受体，其介导拉链效应的受体仍有待鉴定。不论受体的种类，在体外细胞模型上如鼠成纤维细胞(L929)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人单核细胞(THP-1)和鼠巨噬细胞(J774)，II相比I相的感染性强但在侵入胞内后二者有相同的生长特性。另外，前面的LPS部分已介绍了类脂A可抑制TLR4通路，I相LPS可通过SRC酪氨酸激酶介导肌动蛋白细胞骨架的运动。根据以上研究结果，我们推测TLR4可能是Cb的另一主要受体，类脂A与TLR4的结合在抑制炎症反应的同时可能起到受体-配体的拉链作用。

2.2 CCV的早期发育是Cb感染吞噬细胞的关键 CCV的发育无疑离不开Cb蛋白的调控，但具体的蛋白种类及调控机理还不清楚，该过程中的效应蛋白无疑是关键毒力因子。这里的CCV早期发育阶段指的是从发生吞噬至吞噬体产生后的2 h。在这个阶段，CCV具有吞噬溶酶体的典型特征，其大小不发生改变，溶酶体酶类开始积累，囊泡内pH逐渐降至4.5，80%以上的小贝氏体已转化为大贝氏体，也即Cb完成了关键的溶酶体逃逸。

对早期发育的研究主要集中在3个时间点上。吞噬发生后约5 min，CCV与RAB5(小分子GTPase)、EEA1(早期内含体的标记蛋白)和微管结合蛋白LC3(自噬体标记)相结合[23-24]。其中，RAB5刺激CCV与早期内含体的融合使囊泡内pH酸化至约5.4，而CCV与LC3的结合需要未知Cb蛋白的参与。CCV与早期内含体融合后会通过分裂移除部分膜组分以维持恒定大小。吞噬发生后40～60 min，CCV与晚期内含体发生融合分裂，解离RAB5和EEA1，获得RAB7、LAMP1-2(溶酶体相关膜糖蛋白)和ATPase，后者向CCV内泵入质子使pH降至5，60 min后约80%的小贝氏体已转变为大贝氏体[25]。吞噬发生后2 h，CCV与溶酶体组分融合，开始积累溶酶体酶如组织蛋白酶D(CTSD)，ATPase将pH值进一步降至4.5。正常的吞噬体中溶酶体酶在15 min即开始积累，而CCV中溶酶体酶的获得时间发生小贝氏体进行结构变化之前，这可能为小贝氏体向大贝氏体的转化提供了时间窗口。

自噬是宿主天然及获得性免疫的一部分，自噬体标记LC3与新生CCV的结合说明Cb可能通过调控自噬在延迟溶酶体酶积累、小贝氏体结构转变等中发挥作用。自噬在Cb生长中的作用目前仍不清楚。但研究发现，如果在Cb感染细胞前诱导自噬，Cb的生长数量和CCV的体积均会增加[26-27]。自噬囊泡中的原料可能为Cb生长如小贝氏体到大贝氏体转化等提供了必要的营养。另外需要指出的是，CCV的早期发育不需要Cb新合成蛋白质的参与，因为在抑制Cb蛋白合成时CCV仍然可以正常获得LAMP蛋白并酸化，这与正常的吞噬体成熟过程类似。

2.3 CCV的体积增长及菌体分裂离不开Cb蛋白质的合成与分泌 CCV的结构维持需要Cb合成新蛋白质及激活宿主的蛋白激酶C、蛋白激酶A和肌球蛋白轻链激酶，其体积增长需要获得脂类和胆固醇等。内吞后第8 h，Cb的四型分泌系统开始转运效应蛋白，CCV开始具备囊泡融合能力。CCV间可以同源融合，也可与自噬体、内含体和溶酶体的囊泡进行异源融合。在内吞后的8～48 h，CCV早期分泌通路相互作用，不断募集RHO GTPase和RAB1B，体积不断增大直至占据多数胞质空间，与吞噬溶酶体不变的体积形成反差。RHO GTPase可能参与维持囊泡结构，而来自内质网的RAB1B可能参与CCV膜的生长。让人吃惊的是，CCV虽最终占据了大多数细胞质空间，其体积远超出Cb所需要的空间，但宿主细胞的活力没有受到影响，这点与衣原体有相似之处。

2.4 CCV的成熟及菌体扩散 大贝氏体在6 d后充满了CCV，并开始向小贝氏体分化。晚期成熟的CCV仍然保留了前期的特征，包括pH小于4.5～5，与未感染细胞中吞噬溶酶体的pH相同、相同的蛋白标记物、囊泡融合能力及保持了宿主细胞的正常活力(增殖时间和基因组稳定性均未受到影响)。目前对晚期CCV维持宿主细胞的活力与否有不同的看法。一是认为Cb通过抑制凋亡和诱导促生存因子维持被感染细胞的存活力，这可能有利于建立Cb慢性感染。Cb的抗凋亡活性可能是CCV膜蛋白BECN1(自噬启动蛋白)和BCL2(抗凋亡蛋白)间的互作结果，后者可阻止线粒体细胞色素c的释放。另外，Cb感染可持续激活促生存信号通路蛋白ERK1(MAPK3)，ERK2(MAPK1)和AKT家族，从而诱导宿主细胞产生促生存因子。二是认为Cb可诱导细胞色素c的释放及细胞凋亡，以利于Cb扩散至附近的易感细胞。

CCV的生长发育是一个高度有序的宿主和Cb互作的过程，其详细机制仍有待研究。目前对Cb的理解主要来自在体外细胞模型上的研究，我们对Cb在人体内的扩散机制仍知之甚少。Cb是目前已知的致病力最强的病原之一，其最低感染剂量仅为1～10个菌，说明Cb感染人肺泡巨噬细胞后可快速扩散至其它易感细胞或组织。但在常用的Vero细胞上，Cb不能扩散感染相邻细胞，不形成其它胞内菌或病毒上常见的空斑。上面研究发现Cb既可抑制又可诱导凋亡说明Cb可能采取了与其它胞内寄生菌如结核分枝杆菌类似的策略，即在感染早期抑制凋亡以保障增殖，而在感染末期诱导细胞死亡以促进扩散。

3 贝氏柯克斯体的胞内生存离不开Dot/Icm分泌系统(IV型分泌系统)

胞内寄生菌的Dot/Icm(Defect in organelle trafficking/Intracellular multiplication)分泌系统一直受到关注，主要原因是分泌型因子与宿主细胞直接进行对话互作，有可能是关键的毒力因子，深入了解它们的互作机理有可能为研究新型疾病防控策略提供思路。Cb编码I型(T1SS)、II型(T2SS，常与菌毛生长有关)和IV型(T4BSS，常与接合作用相关)共3个分泌系统。目前对CbT1SS和T2SS的了解还很少，对T4BSS的认识多基于嗜肺军团菌替代模型。CbT4BSS与嗜肺军团菌近缘，其分泌底物有4个显著特点：①数量多。目前已鉴定了约120个CbDot/Icm底物，约占Cb蛋白质组的5.8%，而嗜肺军团菌约8.5%的蛋白质可通过Dot/Icm进行转运。②冗余性高。Cb有类似嗜肺军团菌的冗余策略，针对某一信号通路有多个调控型分泌因子以保障胞内生存，如三个分泌因子(AnkG，CaeA和CaeB)均可抑制细胞凋亡。③多样性。不同致病型Cb间的分泌因子有惊人的多样性，在急性Q热和慢性Q热分离株中只发现了19个保守的分泌因子(其中3个来自质粒)[28]。④很多底物中含有真核生物蛋白的结构域，说明部分底物可能通过水平基因传递从真核生物获得，这为研究蛋白功能提供了线索。

为何病原体需要如此多的分泌因子？这些分泌因子是否真正可以分泌到细胞质中？在嗜肺军团菌中，至少30%的Dot/Icm效应子与建立胞内感染没有关联，而与适应不同的宿主有关。Cb可以感染很多哺乳类和节肢类宿主，多样化的T4BSS底物可能有类似的功能，它们在Cb跨物种传播中的作用仍有待研究。Cb与衣原体类似，都在囊泡内增殖并有独特的发育周期。最近国外多个课题组对衣原体CPAF蛋白的研究对目前鉴定囊泡菌分泌蛋白的方法提出了挑战[29]，如何重新鉴定囊泡菌的分泌蛋白已成为当务之急。研究者利用转座和位点特异性突变技术已经确认Cb的胞内存活离不开Dot/Icm系统[18]。今后的研究热点是鉴定特定分泌蛋白的作用靶标及功能。分泌因子是囊泡菌的研究热点，我们将另文综述分析它们的研究进展及存在问题。

4 结 语

Cb分布广泛、感染性强、可引起动物及人多种疾病，特别是慢性Q热致死率高，Cb的防控无疑应引起重视。2007—2010年，荷兰总计超过4 000人感染Q热，传染源被认为是当地的流产家畜[30]。这次疫情是否与Cb流行株的变异有关还不明确，但Cb的遗传多样性说明Cb虽然保守地在吞噬溶酶体样囊泡内增殖但Cb本身仍在不停地进化。我们需要警惕Q热突发暴发的可能，特别是Cb变异后可能会导致人与人之间传播。国内外目前只有少数几个专业实验室从事Cb研究，国外对Cb的研究处于复兴阶段。我国有必要抓住Cb无细胞培养和遗传操作的机遇，加深Cb分子致病机理的研究，为研制方便实用的Q热检测试剂和疫苗等提供新思路。毫无疑问，在遗传学时代，以上概述的LPS免疫调节功能、囊泡发育机制和四型分泌系统仍将是今后的研究热点。

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Song Li-hua, Email: songlihua@gmail.com

Advances on molecular pathogenesis ofCoxiellaburnetii

WANG Tao,SONG Li-hua

(StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing100071,China)

Coxiellaburnetiiis an important zoonotic obligate intracellular pathogen, which can cause wide-spread infections in domestic animals and human Q fever (unknown febrile illness) possibly accompanied by pneumonia, endocarditis, hepatitis, and osteomyelitis, etc. The recent Q fever outbreak in Netherlands raises the alert of Q fever outbreak in other areas. Basic research on Q fever has progressed dramatically owing to the recently developed axenic culture and genetic manipulation ofC.burnetii. This paper reviewed our current understanding of the interactions betweenC.burnetiiand host cells in the aspects of immune modulation by LPS, formation and development ofCoxiella-containing vacuole, and possibly mechanisms of type IV secretion effectors.

Q fever;Coxiellaburnetii; obligate intracellular parasites; zoonosis

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.019

宋立华，Email:songlihua@gmail.com

病原微生物生物安全国家重点实验室，军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071

R376

A

1002-2694(2015)09-0876-05

2014-10-16；

2014-12-24