子宫内膜异位症中HIF—1α和VEGF的表达及临床意义

戴星++++++周静++++++胡鸣++++++孙玉芳

[摘要] 目的 探讨子宫内膜异位症患者缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）与血管内皮生长因子（VEGF）的表达及相关性，两者在子宫内膜异位症发生、发展中的意义。 方法 采用免疫组织化学ElivisionTM二步法分别检测30例子宫内膜异位症（实验组）异位内膜和在位内膜，以及30例正常子宫内膜（对照组）中HIF-1α和VEGF的表达，并对两者表达的相关性进行分析。 结果 HIF-1α在子宫内膜异位症患者异位及在位内膜中的表达水平均强于正常子宫内膜，差异有统计学意义（P<0.05），且在异位内膜中的表达水平强于在位内膜，差异有统计学意义（P<0.05）；VEGF在子宫内膜异位症患者异位及在位子宫内膜中的表达强于正常子宫内膜，差异有统计学意义（P<0.05），且在异位内膜中的表达强于在位内膜，差异有统计学意义（P<0.05）；各组中的增生期和分泌期表达差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 HIF-1α与VEGF在子宫内膜异位症患者异位内膜中的表达增高，且呈正相关。HIF-1α可能通过VEGF在子宫内膜异位症的发生、发展中发挥作用。

[关键词] 子宫内膜异位症；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子；免疫组织化学

[中图分类号] R711.71 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）12（b）-0017-04

子宫内膜异位症是育龄期妇女的常见病、多发病，近年来其发病率呈明显上升趋势[1]，已成为严重影响妇女身心健康与生育功能的难以治愈的疾病。尽管子宫内膜异位症是良性疾病，但它却有着恶性肿瘤类似的生物学特性，诸如侵袭、种植，甚至很可能远处转移。近年来国内外的研究发现，新生血管的生成是子宫内膜异位症发病过程中的关键一环。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能够特异性地作用在血管内皮细胞上，是众多促血管生成因子中最重要的一个[2]，不仅能促使新生血管的生成，而且在子宫内膜异位症发生、发展中发挥着非常重要的作用[3]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是一种关键性的调控因子，它介导了细胞对缺氧微环境适应的反应，并在肿瘤侵袭过程中形成新生血管的环节上发挥着重要的作用。本研究旨在探讨HIF-1α、VEGF与子宫内膜异位症发生、发展的关系，并探讨其如何发挥作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象来源于南昌大学第四附属医院妇产科2011年1月～2014年1月的手术病例。实验组为子宫内膜异位症患者30例，术后经病理证实，获取异位病灶及子宫内膜，其中增生期20例，分泌期10例，平均年龄（44.07±7.49）岁；对照组为因子宫肌瘤行子宫切除、盆腔结构正常的患者30例，获取子宫内膜，其中增生期18例，分泌期12例，平均年龄（46.10±5.19）岁。所选病例术前3个月内未应用过激素类药物，未接受放疗、化疗及手术治疗，均无其他免疫疾病、急性炎症及其他肿瘤病史。所取的组织标本全部经病理学确诊，月经周期按第8版《妇产科学》教材，经HE染色后分为增生期及分泌期。

1.2 主要试剂

鼠抗人VEGF单克隆抗体（即用型）、免疫组织化学ElivisionTM试剂盒、DAB染色试剂盒、磷酸盐缓冲液（PBS）均购自福州迈新生物技术有限公司。兔抗人HIF-1α多克隆抗体为浓缩剂，购自武汉博士德生物工程有限公司；试验时稀释浓度为1∶50。

1.3 方法

所有标本均由10%甲醛固定、石蜡包埋，连续3 μm切片，采用免疫组织化学ElivisionTM二步法非生物素检测系统，已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色。实验操作严格按照说明书进行。

1.4 结果判断

HIF-1α的蛋白阳性信号主要表达在腺上皮细胞胞质内，显微镜下可见呈棕黄色颗粒。VEGF蛋白阳性主要表达在内膜细胞胞质内和血管内皮细胞胞质内。HIF-1α和VEGF蛋白表达的判定均参照Birner等[4]半定量测定的方法，据高倍镜下综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行判定。着色弱但明显强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，染色强者为3分；阳性细胞占总细胞数的判定：10%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分。以上两项评分相加，阳性细胞<10%为（-），3分为弱阳性（+），4～5分为阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用精确概率法以及χ2检验，等级资料采用Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α的表达

HIF-1α蛋白在子宫内膜异位症异位内膜、在位内膜及正常子宫内膜中的阳性表达率分别为80.00%（24/30）、53.33%（16/30）、0（0/30），差异有统计学意义（χ2=40.320，P<0.01）。在异位内膜中的表达高于在位内膜（χ2=4.8，P<0.05）；在异位和在位内膜中的表达高于正常子宫内膜（χ2=21.818，P<0.01）。异位和在位内膜以及正常子宫内膜中增生期和分泌期的表达差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 HIF-1α的表达（n）

2.2 VEGF的表达

VEGF蛋白在子宫内膜异位症异位内膜、在位内膜及正常子宫内膜中的阳性表达率分别为83.33%（25/30）、60.00%（18/30）、6.67%（2/30），差异有统计学意义（χ2=37.067，P<0.01）。在异位内膜中的表达高于在位内膜（χ2=4.022，P<0.05）；在异位和在位内膜中的表达高于正常子宫内膜（χ2=19.100，P<0.01）。异位和在位内膜以及正常子宫内膜中增生期和分泌期的表达差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

表2 VEGF的表达（n）

2.3 HIF-1α与VEGF表达的相关性分析

子宫内膜异位症患者异位内膜中HIF-1α与VEGF表达的相关系数为0.635（P<0.01）（表3），说明HIF-1α与VEGF在子宫内膜异位症患者异位内膜中的表达均呈正相关。

表3 HIF-1α与VEGF表达的相关性分析

3 讨论

缺氧诱导因子-1（HIF-1）是一种核心的转录调控因子，存在于哺乳动物或人体内，能够在低氧条件下促使细胞对缺氧状态进行适应性应答。α和β分别是它的两个亚单位，其中能决定HIF-1的活性的、唯一的氧分子调节亚单位即是HIF-1α[5]。人HIF-1α基因定位于14号染色体q21～24区，其cDNA长3720 bp，可编码含有826个氨基酸残基的多肽链。Simon等[6-7]研究发现，HIF-1α在低氧状态进行应答时起全局调控的作用，可以激活100多种低氧适应性基因的表达，在血管发生及重建、细胞凋亡、红细胞生成、糖酵解等的各个方面。HIF-1α能够调节血管形成的各个阶段，也是缺氧状态下血管生成的关键性的调控因子[8-10]。Sharkey等[11]研究表明，子宫内膜异位症的发病机制之一就是在缺氧的条件下新生血管大量地形成。本研究结果中，HIF-1α在子宫内膜异位症患者异位内膜、在位内膜中呈高表达，在正常子宫内膜中呈低表达，组间两两比较，差异有统计学意义，与任旭等[12]的报道一致，由此提示异位灶组织中HIF-1α有异常的生物学活性，与子宫内膜异位症的发生密切相关，在子宫内膜异位症的早期，异位和在位的内膜相对处于缺氧状态，引起细胞过度表达HIF-1α，促使新生血管形成，因而缺氧可能是子宫内膜异位症发病的一个诱因。HIF-1α在子宫内膜异位症在位内膜的表达明显强于正常子宫内膜，提示发生子宫内膜异位症的原因其中之一可能是月经期脱落的子宫内膜处在缺氧的状态。

HIF-1α调节血管生成的作用主要是通过其靶基因VEGF实现的[13]。目前得到公认的、最强的促血管生成因子就是VEGF，它是血小板衍生生长因子超家族的成员，分子量为34～36 kDa，是一种多肽类生长因子。人类的VEGF基因位于6p21.3染色体，含有7个内含子和8个外显子，全长28 kb。它通过自分泌和旁分泌共同作用，与血管内皮细胞的特异性受体结合，有强大的促内皮增生、促血管生成作用[14]，因此可促进异位病灶的形成。VEGF表达高低直接反映了该组织的血管生成的活性。Maclaren等[15]研究显示，实验组子宫内膜异位症患者异位病灶和腹腔液中的VEGF呈高表达，明显强于对照组，且新鲜红色病灶中VEGF的含量远远大于颜色较暗的陈旧病灶，说明红色病灶属于异位内膜种植的初始阶段，血管生成十分活跃，也证实了子宫内膜异位症的发生依赖于新血管的形成。本研究结果显示，在子宫内膜异位症患者的异位及在位内膜中，VEGF高表达，阳性表达率分别为83.33%和63.33%，明显高于正常子宫内膜中的6.67%，与王春红等[16]的报道一致，提示在子宫内膜异位症的血管形成中，VEGF起到了非常重要的作用，其具有更强的血管生长能力及增殖活性。VEGF含量的增高提示子宫内膜血管生成增多，因此这可能是子宫内膜异位症中异位内膜能够成功种植，进一步生长，最终导致子宫内膜异位症发生的核心步骤和必备条件。

在VEGF的表达的调控中，多种因素共同作用，其中缺氧是诱导VEGF表达的核心因素。HIF-1α能够在多个层面上[8，17]，在基因水平上广泛调控VEGF的表达：它不仅能够启动VEGF的转录，促进VEGF mRNA的蛋白质翻译，还可以上调VEGF受体的转录。因此，在组织缺氧时，HIF-1α被激活，HIF-1α高表达导致VEGF的表达增加，VEGF与存在于血管内皮表面的特异性受体（VEGFR1和VEGFR2）结合，从而发挥强大的促血管生成的作用，促使新生血管形成。然而，新生血管的结构不如正常血管结构完善，并不能改善组织缺氧，反而诱发更多的生长因子和新生血管形成。随着异位内膜的生长，血液供应的相对不足，又引起缺氧，缺氧又反馈引起VEGF的表达，周而复始，促使子宫内膜异位症不断发展。本研究显示在子宫内膜异位症中HIF-1α和VEGF蛋白表达呈正相关，表明VEGF正是通过HIF-1α的调节，促进异位灶的血管形成，致使异位内膜更易于种植在腹膜的表面，存活并增殖，病灶不断扩大，从而促进子宫内膜异位症进一步发展。

子宫内膜异位症的发病机制十分复杂，是多因素综合的动态发展过程，至今为止，发病机制仍在深入探索中。子宫内膜的异位种植和生长离不开充足的血液供应，新血管的形成是子宫内膜异位症发生、发展的关键。因此，抑制血管生成可能成为子宫内膜异位症预防和治疗的新领域。HIF-1α和VEGF的研究有可能成为预防和治疗子宫内膜异位症的新方法。

[参考文献]

[1] Cho S，Choi Y S，Jeon Y E，et al.Expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and its soluble receptor-1 in endometriosis[J].Microvasc Res，2012，83（2）：237-242.

[2] Barcz E，Ploski R，Malejczyk J，et al.An inverse association with vascular endothelial growth factor concentration[J].Fertil Steril，2012，97（6）：1380-1386.

[3] 史淑红，李佃贵，马秀菊.子宫内膜异位症患者腹腔液中血管内皮生长因子及其可溶性受体的测定[J].第三军医大学学报，2007，29（10）：976-978.

[4] Birner P，Schindl M，Obermair A，et al.Overexpression of hypoxiain-ducible Factor-1α is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer[J].Cancer Res，2000，60（17）：4693.

[5] Zhou J，Schmid T，Schnitzer S，et al.Tumor hypoxia and cancer p rogression[J].Cancer Lett，2006，237（1）：10-21.

[6] Simon MC.Siah proteins，HIF prolyl hydroxylases，and the physiological response to hypoxia[J].Cell，2004，117（7）：851-853.

[7] Shi YH，Wang YX，Bingle L，et al.In vitro study of HIF-lactivation and VEGF release by bFGF in the T47D breast cancer cell line under normoxic conditions：involvement of PI-3K/Akt and MEK1/ERK pathways[J].J Pathol，2005，205（4）：530-536.

[8] Pugh CW，Ratcliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia：role of the HIF system[J].Nat Med，2003，9（6）：677-684.

[9] Mazure NM，Brahimi-Horn MC，Pouyssegur J.Protein kinases and the hypoxia-inducible factor-1，two swiches in angiogenesis[J].Curr Pharm Des，2003，9（7）：531-541.

[10] Hellstrsm M，Phng LK，Hofmann JJ，et al.D114 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis[J].Nature，2007，445（7129）：776-780.

[11] Sharkey AM，Day K，Mcpherson A，et al.Vascular endothelial growth factor expression in human endometrium is regulated by hypoxia[J].J Clin Endocrinol Metab，2000， 85（1）：402-409.

[12] 任旭，何援利，彭冬先.缺氧诱导因子21α在子宫内膜异位症中的表达与微血管密度的关系[J].广东医学，2007， 28（2）：229-231.

[13] Bos R，Zhong H，Hanrahan CF，et al.Levels of hypoxia-inducible factor-1 alpha during breast carcinogenesis[J].J Natl Cancer Inst，2001，93（4）：309-314.

[14] 齐璇，辛晓燕，常吉庆，等.血管内皮生长因子在子宫内膜异位症中的表达及意义[J].医学研究生学报，2003， 16（3）：180.

[15] Maclaren J，Prentice A，Chamck-Jones DS，et al.Vascularendothelial growth factor （VEGF） concentrations are elevated in peritoneal fluid of women with endometriosis[J].Hum Rep Rod，1996，11（1）：220-223.

[16] 王春红，魏静波，曲银娥，等.血管内皮生长因子及其受体在子宫内膜中的表达及意义[J].中国免疫学杂志，2013， 29（6）：605-608.

[17] Hirota K.Hypoxia-inducible factor 1，a master transcription factor of cellular hypoxic gene expression[J].J Anesth，2002，16（2）：150-159.

（收稿日期：2014-10-22 本文编辑：郭静娟）