白色念珠菌胃溃疡分离株和胃癌分离株的毒力及磷脂酶活性差异的实验研究

易佳丽+刘亚莉+刘剑辉+刘轶群

[摘要]目的 探讨胃溃疡及各期胃癌患者胃黏膜组织中白色念珠菌的毒力及其磷脂酶的活性的差异。 方法按照菌株来源分组为正常对照组，胃溃疡组，早期胃癌组，进展期胃癌组，各组胃黏膜的菌株在CHROMagar念珠菌显色培养基上进行真菌分离培养与菌种鉴定，采用蛋黄平板法检测白色念珠菌的磷脂酶，以Pz值表示磷脂酶的活性。用白色念珠菌悬液尾静脉注射感染小鼠，以其平均存活时间（d）评价菌株毒力。 结果 与正常对照组比较，各组磷脂酶活性均有所升高，差异有统计学意义，以进展期胃癌组的磷脂酶活力最高，毒力最强，可在5d内致全部小鼠死亡。 结论 随着胃黏膜病理变化恶性程度的升高，所感染白色念珠菌磷脂酶的活性升高，毒力也逐渐增强。

[关键词]白色念珠菌；胃溃疡；胃癌；磷脂酶

[中图分类号]R573 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2014）20-24-03

Experimental study of the differences of virulence and phospholipase activity of Candida albicans in gastric mucosa of patients with gastric ulcer and different stages gastric cancer

YI Jiali1 LIU Yali2 LIU Jianhui3 LIU Yiqun4

1.Administration Office of Medical Vocational Academy， Shenyang 110101， China； 2.Department of Health Inspection， Medical Vocational Academy， Shenyang 110101， China； 3.Department of Inspection Technology， Medical Vocational Academy， Shenyang 110101，China； 4.Department of Statistics， Medical Vocational Academy， Shenyang 110101， China[Abstract]Objective To explore the differences of virulence and phospholipase activity of Candida albicans in gastric mucosa of patients with gastric ulcer and different stages gastric cancer. Methods All the bacterial strain were divided into the normal control group， gastric ulcer group， early gastric cancer group， advanced gastric cancer group according to the sources of strains. The different groups mucosa strains in CHROMagar candida chromogenic medium were fungal isolated and identificated. And the Candida phospholipase was detected by the egg yolk plate method， the phospholipase activity was indicated with Pz values.The Candida albicans suspension was injected into the tail of the mice， and the virulence was evaluated with the mean survival time. Results Compared with the normal control group， the different groups phospholipase activity significantly increased， the difference was significant （P<0.05）. The phospholipase activity in advanced gastric cancer group was the highest， the toxicity was the strongest， and it could make all the mouse death in 5 days. Conclusion With the increase of malignant degree of gastric mucosa， the phospholipase activity of infecting Candida albicans also elevate， the virulence also increase gradually.

[Key words]Candida albicans； Gastric ulcer； Gastric cancer； Phospholipase

胃溃疡在临床上属于癌前疾病，有发生癌变的危险，发生率在1%以下，特别是长期慢性胃溃疡史、年龄在45岁以上，溃疡顽固不愈者应提高警惕。胃癌是最常见、最多发和危害最大的恶性肿瘤之一，居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。白色念珠菌是人类常见的条件性致病真菌之一[1]，常常聚居在正常人的皮肤、口腔、阴道和肠道，易感于免疫功能缺陷或抑制、微生态失衡等患者，引起皮肤、黏膜、皮下组织或系统性感染。研究发现，胃溃疡合并真菌感染者溃疡口愈合进程明显延长，溃疡面积明显大于单纯性溃疡[2]，其中最常见的真菌菌种就是白色念珠菌。除此之外，胃癌患者尚存在机体免疫功能紊乱、微生态环境失衡等情况，加大了白色念珠菌感染机会，据报道胃癌合并真菌感染者达50%，远高于正常人群，且大多数的流行病学资料和基础研究结果均支持白色念珠菌的致癌作用[2]。本实验以辽宁省肿瘤医院胃外科手术患者及内镜室的门诊患者的胃黏膜组织为标本，研究胃溃疡和各期胃癌患者胃黏膜组织中白色念珠菌的毒力及其磷脂酶的表达差异。endprint

1 材料与方法

1.1 标本与菌株

样本主要来源于辽宁省肿瘤医院胃外科手术患者及内镜室的门诊患者，正常对照组，胃溃疡组，早期胃癌组，进展期胃癌组，均选取白色念珠菌感染者每组各10例。

1.2 真菌分离培养与菌种鉴定

在CHROM agar念珠菌显色培养基上进行（白色念珠菌呈绿色）。经形态学观察、芽管生成、厚膜孢子形成实验证实为白色念珠菌。

1.3 蛋白琼脂培养基配置

将3.215g 沙堡氏葡萄糖琼脂、NaCl 29.22g （终浓度1molPL）、CaCl2 0.2775g或CaCl2·H2O 0.3675g（终浓度0.005molPL）溶解于500mL蒸馏水中，高压灭菌，冷却后加入8%无菌蛋黄40mL。

1.4 磷脂酶的检测

在蛋黄琼脂培养基上平放直径为6mm的圆形消毒滤纸片。白色念珠菌在SDA 上37℃生长24h后，用无菌生理盐水调节菌悬液浓度，OD520nm值0.075～0.080，滴加6μL菌悬液于培养基中的滤纸上，设无菌蒸馏水滴加6μL的阴性对照组，37℃孵育5d后观察结果。每一分离株分别重3次实验。

1.5 磷脂酶活性判定

采用QW500 计算机辅助测量软件，分别测定滤纸上菌落生长的面积和菌落四周产生的明显的、界限清晰的、致密白色的沉淀环的面积，然后计算二者面积之比，得Pz值，即为磷脂酶活性[3]取每个菌株的3次重复试验测量值的平均数作为该菌株的Pz值纳入统计处理。根据此计算方法可知Pz值的大小与白色念珠菌的磷脂酶活性大小成反比。Pz>0.95，可认为磷脂酶活性阴性。

1.6 白色念珠菌动物毒力试验

选用清洁级昆明雌性小鼠（体重18～20g），随机分组，每组10只小鼠，自1.2项取相应菌株的菌悬液，经4000r/min离心10min，去上清，用无菌盐水洗菌3次，再用无菌盐水稀释成5×106/mL菌悬液，经尾静脉给小鼠注射此菌液0.2mL，每组菌株接种一组小鼠，对照组小鼠给予无菌盐水0.2mL尾静脉注射。逐日观察小鼠活动情况，连续14d，以小鼠平均生存天数评价菌株毒力。

2 结果

2.1 磷脂酶活力

37℃孵育5d后，蛋黄培养基上各组菌株孢子悬液的部位都有白色菌落的生长，菌落周围出现白色的沉淀圈，滴加无菌蒸馏水的空白对照组无菌落生长以及白色沉淀圈的生成。计算各组的Pz值，经过统计学处理，结果见表1。与正常对照组比较，各组的磷脂酶活性均有所升高，差异有统计学意义，随着各组胃黏膜病理变化恶性程度的升高，所感染白色念珠菌的磷脂酶的活性也升高。

2.2 毒力试验

结果表明随着胃黏膜病理分型恶性程度的升高。其菌株菌株分泌的磷脂酶的活力越高，对小鼠的毒力也就越强。进展期胃癌组的菌株可在5d内致全部小鼠死亡，胃溃疡组的菌株在第14天也使小鼠的死亡率达到100%，而正常对照组的菌株使小鼠的死亡率在14d内达到了30%。见表2。

3 讨论

白念珠菌是一种重要的条件致病性真菌，它寄居在人体不同的解剖部位，包括皮肤、口腔、胃肠道、阴道等[4]。它是消化道正常菌群成员但非优势种群，只以胞子形式存在。只在宿主免疫力下降的情况下，其毒力增强、数量变多而成为口腔微生物的优势种群[5]。文献资料[6]报道在胃中的白色念珠菌，可能是导致胃部疾病的机制之一。由于胃黏膜受损、黏膜局部循环障碍及细胞免疫功能低下而诱发念珠菌广泛侵入胃黏膜细胞，在切除的胃癌组织中，念珠菌的分离率亦高达42.0%[7]。白色念珠菌的致病主要与黏附能力、形态转换和胞外酶有关[8]。本研究结果表明，在各种胃黏膜疾病中，随着病变的胃黏膜组织的病理分型的恶性程度增高，所感染的白色念珠菌也发生变化，其表达的磷脂酶的活性也逐渐升高，以进展期胃癌组的磷脂酶活性最强。目前已确认，白色念珠菌壁上的？-葡聚糖具有抗肿瘤作用即宿主介导抗肿瘤活性，在白色念珠菌没转变成致病菌时，它有抗肿瘤的作用；但其通过粘附能力（甘露聚糖、甘露聚糖蛋白质复合物、几丁质、受体和粘附素）增强、形态转换（以菌丝形态生长）、胞外酶（分泌性酸性蛋白酶和磷脂酶）作用而转变为致病菌后，特别是白色念珠菌形态转化过程中，？-葡聚糖始终被甘露糖蛋白和几丁质包围着，机体免疫系统无法识别？-葡聚糖及杀死致病菌，从而形成肿瘤发生及加重的原因之一[9]。本研究中可以发现，来自不同病理分型的胃黏膜组织的白色念珠菌的磷脂酶的活性大小也不同，我们采用动物实验的方法证明，随着胃黏膜病理分型恶性程度的升高。其菌株菌株分泌的磷脂酶的活力越高，对小鼠的毒力也就越强，胃癌患者感染了白色念珠菌后，不但肿瘤的发生发展加快，白色念珠菌的毒力也有所增长。来自胃癌患者肿瘤组织的菌株毒力远远大于来自胃溃疡患者病变组织的菌株毒力，进展期胃癌组的菌株毒力更甚。Kothavade等[10]证实了磷脂酶与小鼠播散性念珠菌病具有明显的相关性， 认为是白念珠菌血源性感染重要的毒力因子。因此，这种毒力效应并不能排除消化道的正常菌群进入血液后由于菌群易位[11]。白念珠菌作为共栖菌和致病菌与人类共存或在，有许多基因编码毒力因子[12]，因此白念珠菌间潜在的某种情况下致病还是作为微生态环境改变而引发的毒理效应，还有待进一步研究探讨。

[参考文献]

[1]孙鹤龄.医学真菌鉴定初编[M].北京：科学出版社，1987：78-95.

[2]郑剑玲，王垂杰，齐贺，等.胃病患者胃黏膜真菌感染的检测[J].微生物学杂志，2010，30（1）：100-105.

[3]苑天红，王明永，吴升伟.白念珠菌二相性与毒力关系的实验研究[J].中国皮肤性病学杂志，2004，18（10）：580-582.

[4]陈雪蓉.白念珠菌毒力因子的研究进展[J].中国妇幼保健，2007，22（32）：4631-4633.

[5]高仕瑛，杨斌贝.口腔念珠菌感染与肿瘤患者[J].中国微生态学杂志，2003，15（5）：269.

[6]阳长青.肿瘤标志物在真菌性胃溃疡及溃疡型胃癌鉴别诊断中的应用价值[J].国际检验学杂志，2009，30（2）：116-1169.

[7]高仕瑛，唐跃华，万艳平.胃癌患者消化道念珠菌的检出及其生物学特征[J].衡阳医学院学报，1989，17（2）：135-140.

[8]任南，文细毛.白色念珠菌致病机制的研究进展[J].中国感染控制杂志，2003，2（2）：157-158.

[9]戚燕，崔进.白色念珠菌壁β-葡聚糖抗肿瘤作用研究概况[J].中国实用医药，2009，4（2）：242-244.

[10]Kothavade RJ，Panthaki MH.Evaluation of phospholipase activity of Candida albicans and its correlat ion w ith paghogenicity in mice[J].Med Microbio，1998，47（2）：99-102.

[11]高仕瑛，刘碧源.白色念珠菌胃癌株的毒力与蛋白酶的关系[J].中国公共卫生，2003，19（1）：25-26.

[12]廉翠红，刘维达.白念珠菌黏附和侵入相关的毒力因子研究进展[J].国外医学（皮肤性病学分册），2004，30（5）：323-325.

（收稿日期：2014-07-14）endprint