CUMS所致大鼠抑郁行为的性别差异与HPA轴功能及BDNF表达相关性研究

蒋建新,成为荣,徐 西,杨 涌

(1. 广西桂林市精神卫生中心,广西 桂林 541001；2. 江苏省南京脑科医院,江苏 南京 210029)

CUMS所致大鼠抑郁行为的性别差异与HPA轴功能及BDNF表达相关性研究

蒋建新1,成为荣2,徐 西2,杨 涌1

(1. 广西桂林市精神卫生中心,广西 桂林 541001；2. 江苏省南京脑科医院,江苏 南京 210029)

目的 探讨慢性轻度不可预见性刺激(CUMS)所致大鼠抑郁行为性别差异与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)及脑源性神经营养因子(BDNF)表达的相关性。方法 选择雌雄各半的远交群SD大鼠64只，以随机数字表格法为分配依据分雌性对照组、雄性对照组、雌性模型组以及雄性模型组，每组16只。应用CUMS以及孤养模式来建立大鼠抑郁模型。应用糖水消耗及高架迷宫法评估大鼠抑郁行为程度，应用Western-blot法检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)mRNA蛋白表达及转录水平，应用荧光定量PCR法检测大鼠海马BDNF mRNA蛋白表达及转录水平，应用放射免疫法检测大鼠血清皮质酮(CORT)含量。结果 雌性模型组与雄性模型组高架迷宫开放臂次数、开放臂停留时间、糖水偏爱率、向下探究次数均显著少于雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)，血清CORT含量、下丘脑CRF mRNA蛋白表达及转录水平均明显高于雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)，而大鼠海马BDNF mRNA蛋白表达及转录水平则明显低于雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)。雄性模型组大鼠进入高架迷宫开放臂与关闭臂次数、中央停留时间、糖水偏爱率、向下探究次数、血清CORT含量、下丘脑CRF mRNA蛋白表达及转录水平明显低于雌性模型组(P均<0.05)，但关闭臂停留时间显著长于雌性模型组(P<0.05)。结论 CUMS所致大鼠抑郁行为的性别差异与HPA轴功能及BDNF表达有密切关系，可为抑郁症的防治及机制研究提供有力实验依据。

大鼠；抑郁行为；下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴；脑源性神经营养因子

抑郁症作为一种情感障碍性精神类疾病，具有高患病率以及高自杀率的特点，目前已经成为了世界性的第四大类疾病，据世界卫生组织的详细统计，至2020年，抑郁症会成为仅次于冠心病的世界第二大疾病[1]。流行病学的相关分析显示，女性出现抑郁症的概率要明显高于男性，比例高达3∶1[2],目前抑郁症性别差异的相关机制还不明确。近年研究发现,抑郁症与促肾上腺皮质激素释放因子(GRF)的分泌情况、血清皮质酮(CORT)的含量升高以及下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴功能的失调均有关联[3-4]。HPA轴功能亢进患者，其脑源性神经营养因子(BDNF)表达明显升高[5]，可见BDNF以及HPA轴在抑郁症的发病中有重要作用。本研究应用慢性轻度不可预见性刺激(CUMS)方式建立大鼠模型，进而探讨抑郁行为的性别差异与HPA轴功能及BDNF表达的关系，旨在为进一步寻找性别差异机制及预防措施提供参考依据。

1 实验资料

1.1 动物 清洁级远交群SD大鼠64只，雌雄各半，8周龄，体质量185～220 g。

1.2 试剂与仪器 蛋白定量BCA及蛋白裂解液购自博士德生物工程有限公司，CORT放射免疫试剂盒购自上海博研生物科技公司，山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(均为HRP标记)购自中杉金桥生物科技公司，兔抗鼠BDNF多克隆抗体以及ECL发光试剂盒分别购自美国的Milipore与Pierce公司，兔抗鼠CRF多克隆抗体与RNA抽提试剂盒分别购自美国的Abcam与OMEGA公司，凝胶成像系统、PCR仪、微量核酸定量仪购自美国Biorad公司，逆转录试剂盒与荧光定量PCR购自日本TaKaRa公司。

1.3 动物及分组模型 取雌雄各半的64只大鼠，自由饮水摄食，并在通风良好的实验室环境中适应性饲养1周后，按照随机数字表格法将大鼠分为雌性对照组、雄性对照组、雌性模型组与雄性模型组，每组16只。保持正常的光照以及饮水摄食。雌性模型组与雄性模型组依照孤养以及CUMS方式建立抑郁模型，使用通宵与间歇照明法对大鼠进行刺激，光照法的光暗周期为2 h/2 h，同时选择2 h噪声、1 min夹尾、40～50 V电击3 min、在4 ℃冰水中游泳5 min、禁水禁食24 h以上、在热环境下5 min以及保持鼠笼倾斜角度45°超过24 h等共11种刺激方法，每日要随机安排1种，每种刺激要重复2～3次，且不可连续性地出现同种刺激，整个刺激实验周期为4周，在第29—30天分别进行高架迷宫与糖水消耗实验。

1.4 大鼠行为学相关检测

1.4.1 高架迷宫测试 高架迷宫的主要配件装置包括底座(40 cm)、两臂十字交叉(40 cm×10 cm)、中央格(10 cm×10 cm)，实验环境需要安静且明暗要合适，将参选实验大鼠放进中央区域，并注意头部要朝向开放臂，随后要详细记录下在5 min内大鼠开放臂进入次数以及关闭臂进入次数，在开放臂、关闭臂及中央区域的停留时间，此外还有大鼠后肢的站立次数及开放臂向下探究的次数。

1.4.2 糖水消耗测试 在大鼠抑郁模型建立完成前，需要训练大鼠在24 h饮用糖水10 g/L及纯净水，训练成熟后可开始正式试验。首先要予以大鼠禁食禁水24 h，随后将大鼠放置于单笼中，保持环境的安静和明暗舒适，然后予以大鼠0.6 L纯净水与10 g/L糖水，观察1 h后大鼠纯净水及糖水的消耗量并记录下来，计算糖水偏爱率：糖水消耗/总液体消耗×100%。

1.5 血清CORT含量检测 在各组中分别选取4只大鼠，取其静脉血，3 000 r/min离心处理10 min，随后将血清分离再于-20 ℃下保存，应用血清CORT放射免疫试剂盒测定其含量。

1.6 下丘脑CRF mRNA及海马BDNF mRNA转录水平检测 在各组中分别随机取4只大鼠，断头后取其脑组织、下丘脑与海马，每100 mg脑组织中加入1 mL RNAstore，并将下丘脑与海马浸泡于其中，4 ℃下过夜后弃掉液体，下丘脑与海马组织保存于-80 ℃下备用。应用荧光定量PCR法进行检测，引物的设计可参照在GenBank中登陆的CRF、BDNF以及内参β-actin基因序列。大鼠海马与下丘脑组织的总RNA可使用RNA抽提试剂盒进行提取，随后予以逆转录合成为cDNA，并将其作为模板，行荧光定量PCR扩增，最后记录CRF与海马BDNF基因mRNA转录水平。

1.7 下丘脑CRF及海马BDNF蛋白水平检测 在各组中分别取4只大鼠，断头后取其脑组织，下丘脑与海马分离，并将组织保存于-80 ℃下。应用BCA法测定脑组织匀浆总蛋白，含量，取样品蛋白30 μg，分离处理后将其转移至NC膜上，在室温下于脱脂奶粉中封闭1 h，分离后在1∶1 000稀释的条件下加入兔抗鼠CRF及BDNF多克隆抗体，同时加入1∶5 000稀释条件下的山羊抗鼠β-actin单克隆抗体，在4 ℃下过夜保存，室温下TBST洗涤处理2次，加入山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG(1∶3 000稀释，均HRP标记处理)。在室温下孵育2 h，随后应用TBST洗涤2次，进行ECL显色处理，最后使用Bio-Rad凝胶成像仪摄取凝胶图像，随后予以吸光度分析。

2 结 果

2.1 高架迷宫测试结果 雌性模型组与雄性模型组大鼠迷宫开放臂进入次数、开放臂停留时间以及向下探究次数均显著少于雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)，但关闭臂停留时间明显长于雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)；雄性模型组大鼠迷宫开放臂以及关闭臂进入次数、直立及向下探究次数、在中央区停留时间均明显少于雌性模型组(P均<0.05)，而关闭臂停留时间明显长于雌性模型组(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠的高架迷宫测试结果比较

注：①与雌性模型组比较，P<0.05；②与雄性模型组比较，P<0.05。

2.2 糖水消耗测试结果 雄性模型组糖水偏爱率为(28.22±35.33)%，雄性对照组为(84.98±9.10)%，2组比较差异有统计学意义(t=-12.467，P<0.05)；雌性模型组糖水偏爱率为(72.73±13.05)%，雌性对照组为(88.54±2.73)%，2组比较差异有统计学意义(t=7.843，P<0.05)；且雄性模型组糖水偏爱率显著低于雌性模型组(t=8.389，P<0.05)。

2.3 血清CORT含量测定结果 雌性模型组血清CORT含量为(331.36±24.16)ng/mL，雌性对照组为(304.14±4.58)ng/mL，2组比较差异有统计学意义(t=-13.675，P<0.05)；雄性模型组CORT含量为(296.56±8.16)ng/mL，雄性对照组为(269.89±4.43)ng/mL，2组比较差异有统计学意义(t=8.733，P<0.05)。同时雌性模型组CORT含量明显高于雄性模型组(t=-10.547，P<0.05)，雌性对照组CORT含量明显高于雄性对照组(t=7.682，P<0.05)。

2.4 下丘脑CRF及海马BDNF mRNA转录水平 雌性模型组与雄性模型组海马BDNF mRNA转录水平明显低于相对应的雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)；而雌性模型组与雄性模型组下丘脑CRF mRNA转录水平明显高于相对应的雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)。雌性模型组下丘脑CRF mRNA转录水平明显高于雄性模型组(P<0.05)，雌性模型组大鼠海马BDNF mRNA转录水平亦明显高于雄性模型组大鼠(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠下丘脑CRF mRNA及海马BDNF mRNA转录水平比较

注：①与雌性模型组比较，P<0.05；②与雄性模型组比较，P<0.05。

2.5 下丘脑CRF及海马BDNF蛋白表达情况 雌性模型组与雄性模型组海马BDNF蛋白表达水平显著低于相对应的雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)；而雌性模型组与雄性模型组下丘脑CRF蛋白表达水平则明显高于相对应的雌性对照组与雄性对照组(P均<0.05)；雌性模型组下丘脑CRF蛋白表达水平高于雄性模型组(P<0.05)，而雌性模型组海马BDNF蛋白表达水平亦明显高于雄性模型组(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠下丘脑CRF 及海马BDNF 蛋白表达水平比较

注：①与雌性模型组比较，P<0.05；②与雄性模型组比较，P<0.05。

3 讨 论

CUMS在当前是十分典型的且比较常用的抑郁模型建立方法，抑郁症的低水平、中慢性应激源促使病情发生或者加速的机制是其主要理论参考依据[6-7]。因此本研究通过孤养并结合COMS模式来建立大鼠抑郁模型，结果显示，COMS雄性与雌性模型大鼠在高架迷宫、糖水消耗测试中均明显表现出了焦虑抑郁的行为，且高架迷宫开放臂进入次数、开放臂停留时间以及向下探究次数雌性与雄性模型组大鼠明显少于雌性与雄性对照组大鼠，可见模型组两性大鼠的抑郁行为已经十分明显，同时雄性模型组大鼠迷宫开放臂以及关闭臂进入次数、直立与向下探究次数、在中央区停留时间较雌性模型组降低更为明显，可见雄性模型组大鼠的抑郁行为更为显著。另外，两性模型组大鼠的糖水偏爱率要明显低于对应的对照组，且雄性模型组大鼠的糖水偏爱率较雌性模型组大鼠低，可见抑郁模型大鼠已经出现了明显的兴趣缺失，且雄性模型组大鼠的兴趣缺失更为强烈，抑郁行为更加明显。

HPA作为神经内分泌系统的重要成分，一旦发生应激情况，该轴的激活以及因此所引发的各种系列变化都是应激反应的重要特征。HPA轴亢进是慢性应激对机体造成损伤的一种重要体现和环节，其与抑郁症的发生和进展有着密不可分的关系。血清CORT及CRF大量的分泌是HPA轴亢进的2个重要指标。本研究结果显示，两性模型组血清含量明显高于两性对照组，且雌性模型组CORT含量高于雄性模型组，雌性模型组CRF表达高于雄性模型组，雌性对照组CRF表达高于雄性模型组，但差异无统计学意义，提示女性抑郁症的发病率要高于男性，这可能与女性患者CORT及CRF表达较高有关，

近年来的研究中发现，BDNF的表达有一定的抗抑郁作用，同时其在机体内的水平也可以作为反映重度抑郁患者治疗与预后的指标[8]。在慢性应激刺激下，大鼠海马BDNF表达有所减少，从而减弱了其对HPA轴的抑制影响。本研究结果显示，两性对照组大鼠BDNF表达情况比较差异无统计学意义，而两性模型组BDNF表达较两性对照组有所降低，可见CUMS对BDNF的表达有一定抑制作用，且雄性大鼠的BDNF表达水平明显低于雌性大鼠，这可能与雄性大鼠抑郁行为重于雌性大鼠有关。

综上所述，CUMS所致大鼠抑郁行为有明显的性别差异，雄性大鼠明显重于雌性大鼠，这与在接受应激刺激时大鼠海马BDNF表达程度不同及HPA轴功能差异有关，为临床治疗及预防抑郁症提供了有价值的参考依据。

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Study on the correlation between the gender difference in depressive behavior of rats induced by CUMS and function of HPA axis and BDNF expression

JIANG Jianxin1, CHENG Weirong2, XU Xi2, YANG Yong1

(1.Guilin Mental Health Psychiatric Center, Guilin 541001, Guangxi, China; 2.Nanjing Brain Hospital, Nanjing 210029, Jiangsu, China)

Objective It is to investigate the correlation between the gender differences in depressive behavior of rats induced by CUMS and hypothalamic pituitary adrenal axis (HPA) and brain derived neurotrophic factor (BDNF) expression. Methods 64 case of each half of the male and female of outbred group SD rats were selected, and divided into 4 groups by using random number table method as female control group, male control group, female model group and male model group with 16 rats in each group. The rat model of depression was built by CUMS and isolated feed mode. The degree of the depressive behavior of rats was valued by sugar consumption and elevated maze method. The protein expression and transcription level of corticotrophin releasing factor (CRF) mRNA in hypothalamus were detected by Western-blot method. The protein expression and transcription level of Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) mRNA in hippocampus were detected by fluorescence quantitative PCR. The content of serum corticosterone (CORT) of rats was detected by radioimmunoassay. Results The number of into open arm, residence time in opened arm, sucrose preference rate and times of down inquiry of male and female model groups were significantly decreased than that of female and male control group (allP<0.05); and the content of serum CORT and hypothalamus CRF protein expression and transcription level of mRNA were increased significantly than that of female and male control groups (allP<0.05); while the rat hippocampus BDNF protein expression and transcription level of mRNA were significantly decreased than that of female and male control groups (allP<0.05). The times of into elevated maze opened arm and closed arm, the central residence time, sucrose preference rate, times of down inquiry, serum CORT content, hypothalamus CRF protein expression and transcription level of mRNA in male model group were significantly lower than that in female model group (allP<0.05); but the closed arm retention time was significantly longer than that in female model group (P<0.05). Conclusion The gender differences in depressive behavior of rats induced by CUMS have close relationship with the expression of HPA and BDNF axis function; it can provide strong experimental evidence for the prevention and cure and study of mechanism of depression.

rats; depressive behavior; Hypothalamus-pituitary-adrenal axis; brain derived neurotrophic factor

蒋建新，男，主治医师，主要从事双相情感障碍的临床和基础研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.12.008

R-332

A

1008-8849(2015)12-1276-04

2014-12-20