鹿作为生物医学模型的研究进展

孙红梅，金美伶，路晓，李春义

(中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，长春 130112)

在生物学和医学发展过程中，动物模型起到了不可磨灭的作用。尤其是哺乳动物，在进化关系上与人类最近，更是研究者们所青睐的。鹿为偶蹄目有角的反刍动物，具有很高的经济价值。鹿茸是名贵中药材，鹿肉可食用，鹿皮可制革，目前，国内、外已大量进行人工饲养。此外，在生物医学领域，鹿所产的鹿茸还是非常独特的研究模型。首先，鹿茸作为目前所知的唯一一个能够周期性完全再生的哺乳动物器官，可以为再生医学领域提供了解哺乳动物器官再生的研究模型；鹿茸成骨过程与长骨形成过程相似，且含血管软骨具有快速生长、完全再生的特性，可以为长骨生长及关节软骨损伤修复研究提供优秀的研究模型；鹿角柄(着生于鹿头部额骨的永久性骨桩，鹿茸角在其上脱落与再生)的无伤疤愈合现象可以为生物医学领域研究伤口愈合提供模型；此外，鹿茸骨化期鹿体骨骨质疏松，但骨化后很快恢复正常水平的现象也为骨质疏松的治疗提供了很好的研究契机。

1 鹿茸作为再生医学模型

近年来，再生医学的迅猛发展为机体损伤组织和器官的再生带来了新的希望。最引人注目的器官再生莫过于割处再生(Epimorphic regeneration)[1]。至今我们对割处再生的了解主要来自于低等脊椎动物，特别是两栖类，如蝾螈断肢再生的研究[2]。这些动物之所以能够实现断肢再生，是由于位于其肢体残桩断面的已完全分化的细胞有进行反分化变成胚胎样细胞的能力[3]。这些胚胎样细胞随后在愈合的表皮之下进行分裂并积聚，在断面上形成一个锥形体。这个锥形体被称为胚芽(Blastema)。这个胚芽就具备了完全再生出失去那部分肢体的潜力[4]。因此，两栖类断肢再生被称为基于胚芽的割处再生[5]。哺乳动物肢体残桩断面的细胞是否也存在着这种反分化的潜力，如果要刺激哺乳动物割处再生是否也要首先诱导胚芽的生成才能实现目前还不清楚。而鹿茸是目前所知的唯一一种在自然情况下能够周期性完全再生的复杂哺乳动物器官[6]，为我们提供了一个难得的了解自然界是怎样解决哺乳动物器官再生的机会。鹿茸的再生是以年为周期的[7]。每年春天，鹿茸在鹿角(完全骨化的鹿茸)脱落后由角柄(着生于鹿头部额骨上的永久性骨桩)处开始再生；春末夏初，再生的鹿茸进入快速生长期，其生长速度可达2cm/d；到了秋季，鹿茸生长由于茸组织的快速骨化而中止。其后茸皮干枯、剥落，露出坚硬的骨角，这时的鹿茸就变成了鹿角；在冬季，裸露的死骨角牢牢地附着在活组织角柄上；直到第2年春天，鹿角才由角柄上脱落，这就又触发了新一轮的鹿茸再生。

鹿茸具有惊人的再生能力，因此，引起了广大学者的广泛关注。近年来，通过对鹿茸的形态[8]、组织学[9]以及细胞生物学的研究，探讨了鹿茸再生的机制，结果表明，鹿茸再生的生长中心由有限的被激活的角柄末端骨膜细胞所形成。鹿的角柄骨膜是鹿茸再生的关键组织。为了揭示为什么如此有限的角柄骨膜细胞(由立体组织学得出约3.3百万个)在这么短暂的时间内(约60d)能再生出近10kg重的复杂鹿茸组织的机制，许多研究者从不同的角度对角柄骨膜细胞进行了深入地研究[8，10]，结果发现，这些细胞具备胚胎干细胞的一些特性。例如表达关键的胚胎干细胞的标记物Oct4、Nanog、CD9、Telomerase和Nucleostemin，这就解释了为什么角柄骨膜细胞具有自我更新能力和巨大的分裂潜力。另外，角柄骨膜细胞能在离体条件下被诱导分化成成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌纤维细胞和神经样细胞，这就解释了为什么能由角柄骨膜细胞再生出复杂的含有神经、血管和不同发育阶段的软骨及骨组织的鹿茸。因此得出结论，鹿茸再生是基于干细胞的割处再生，鹿茸再生的干细胞存在于角柄的骨膜中。鹿茸再生从本质上不同于基于胚芽再生的两栖类断肢再生[11]。

鹿茸的再生开始于鹿角脱落。鹿角脱落后，角柄末端留下一个硕大的伤口，角柄皮肤整层向心生长，逐渐覆盖角柄断端，同时角柄末端的角柄骨膜细胞被激活，分化形成鹿茸的生长中心，支持鹿茸的再生，最后形成鹿茸的主干和眉枝。鹿茸的再生过程与老鼠断肢的愈合过程非常相似，老鼠长骨砍断之后，伤口处长骨的断端死掉，也是断肢整层皮肤向伤口中心迁移，同时激活长骨骨膜细胞，分化形成软骨，软骨向长骨开口处迁移，逐渐将伤口封闭，最后变成骨质。与鹿茸再生不同之处仅在于，老鼠长骨伤口愈合后软骨停止了生长，不能再生出新的长骨。因此，研究鹿茸的再生，对老鼠等哺乳动物断肢再生具有一定的指导意义。

作为雄性鹿的副性器官(驯鹿除外)，鹿茸再生受到鹿体内雄激素水平的控制[12]。Li等的薄膜插入试验和裸鼠异体移植试验揭示[13，14]，鹿茸再生是鹿体内雄激素水平降到一定临界值以下时所触发的角柄骨膜细胞和包裹角柄的皮肤细胞间相互作用的结果。角柄骨膜细胞诱导角柄皮肤表皮变成鹿茸表皮；反过来，鹿茸表皮细胞的反馈信号激活了角柄骨膜细胞的快速分裂繁殖，从而形成再生鹿茸的生长中心。角柄骨膜和皮肤细胞间的相互作用是鹿茸再生所必须的，而这种相互作用是通过交换游离的小分子物质而实现的。因此，鉴别和分离出这些参与鹿茸再生过程的游离小分子物质，不但对研究哺乳动物器官再生的机制具有重要意义，而且也可能是实现除鹿茸以外其他哺乳动物(包括人在内)器官再生的有效途径之一。今天的再生医学已清楚地证明哺乳动物同样存在着组织和器官再生的潜力，研究如何去激活这种潜力是当代再生医学的任务之所在[14～17]。研究认为，使用刺激鹿茸再生的物质可能是激活哺乳动物器官再生潜力的有效方法之一。因此，对鹿茸再生机理的研究，有利于为哺乳动物乃至人类断肢的再生开辟有效途径。

2 鹿茸作为骨发育及软骨损伤修复模型

鹿茸是一个骨质性器官，生长于体外，易于观察，成对出现呈镜像对称，具备作为研究模型的主要特性，而且其组织的发生与骨骼骨质的发生是相同的，包括膜内成骨和软骨内成骨2种成骨形式，但茸骨组织的形成是膜内成骨还是软骨内成骨，许多专家观点不一。有些人认为是由膜内成骨而来；有些人认为是由软骨内成骨而来；还有的人认为是既有膜内成骨，又有软骨内成骨[18，19]。Banks等[20]通过组织化学实验对此做了详尽的研究，得出鹿茸组织是由不同于典型软骨内成骨的特殊的软骨内成骨而来，其标志是角柄顶端软骨膜下出现连续的骨小梁。在整个生茸期内，软骨膜持续存在，通过附加增生来实现鹿茸的生长。发育到一定程度的肥大软骨细胞向细胞间质中分泌X型胶原纤维等，引起间质的钙化，进而骨组织替换软骨组织。与长骨的形成相比，鹿茸的组织结构分化非常细致，既包括成软骨细胞、成骨细胞，又包括前成软骨细胞和前成骨细胞。研究鹿茸软骨内成骨的发生机制可为研究长骨的骨化机制、骨质疏松病发病机理提供一些重要的理论依据。

众所周知，软骨是唯一没有血管分布且细胞组成很单一的一种独特组织[21]，具有很强的抗压、抗撞击能力。也正因为如此，软骨组织几乎丧失了自我修复能力[22]。因此，临床上修复软骨损伤的途径和方法以导入脉管系统或移植细胞到受损部位为核心[23]。为了获得脉管系统，许多研究者通过软骨下骨钻孔来使软骨暴露给血管，驱动内部软骨修复，然而这种途径驱动软骨形成只能提供暂时的纤维软骨环，而不具备持久的生物学功能[24]；一些研究者也曾尝试着采用多种方法移植细胞到受损关节软骨，然而，这些修复过程缺乏移植组织与宿主组织之间的完全融合，愈后结果都不理想[25，26]。目前为止，仍然没有一个已证明的令人信服的通用方法能将损伤的软骨修复到正常功能水平[27]。

鹿茸软骨是非常独特的软骨组织，它不仅在自然条件下能够修复、再生，而且每年以一种惊人的速度(可达2cm/d)再生[4，5]。研究表明，鹿茸具有这种能力主要原因就是鹿茸软骨结构比较独特，软骨组织内分布着大量的血管网[28，29]。与体骨的软骨内骨化过程不同，鹿茸软骨形成与血管形成是一体的，间充质细胞分化首先形成含有血管的前骨质，然后被骨所替代，不经历血管侵入的过程。由于鹿茸软骨含有血管的特性，鹿茸的前骨质组织是否为真正的软骨这一问题在20世纪中期一直存在争议。为了弄清楚这一问题，Banks和Frasier[30]分别进行了鹿茸超微结构和鹿茸软骨基质的免疫化学研究，确定了鹿茸前骨质组织具有软骨的结构特点，得出鹿茸的含血管前骨组织为真正的软骨结论[20，31，32]。鹿茸含血管软骨的形成是鹿茸快速生长期高代谢水平的需要。鹿在进化的过程中，以鹿茸作为第二性征，为了在发情季节使用鹿茸作为争夺配偶的武器，鹿必须在有限的时间内完成大量的(对马鹿来说，鹿茸将近1m高)骨质器官——鹿茸的快速生长[33]。形成骨组织最快的方式莫过于软骨内骨化(先形成软骨，然后通过软骨重塑被骨所替换)，但是软骨组织有它的缺点，即无血管特性，只能通过扩散获得营养，而扩散距离终究是有限的。按常规理论，为了按时完成鹿茸的快速生长，间充质细胞必须以绝对快的速度增殖，然后分化成软骨，这样就需要软骨重塑和成骨替换过程与之保持相同的速度，以保证深层细胞获得充足的营养和氧气。然而，鹿茸的形成并不完全遵循这样的过程，在鹿茸生长中心保留着大量的软骨，鹿茸创造了一种允许间充质细胞在低氧环境的软骨中心分化成血管内皮细胞，形成血管系统的途径，这样不仅保持了软骨的快速形成，也不会因滞后的软骨重塑和骨替换而抑制鹿茸的快速生长。如果将鹿茸再生来源的骨膜组织移植到裸鼠体内或者弥散腔中，限制鹿茸干细胞的分裂分化速度，结果这些细胞可以分化成无血管的常规软骨[34，35]。因此，鹿茸含血管软骨的形成是鹿茸完成快速生长的需要。鹿茸生长速度越快，血管形成也就越多。因此，对鹿茸软骨及软骨内血管形成机制的研究，可以为软骨损伤修复打开一个新的通路。

3 无伤疤伤口愈合模型

鹿茸的再生是由角柄末端伤口愈合开始的。大型鹿种(如赤鹿和马鹿)的角柄末端伤口直径可达60mm～70mm(最大的可达10cm)。形态学研究结果表明[31]，鹿角脱落后，角柄末端周围的皮肤开始在断面上向心生长。与角柄的皮肤(典型的头皮)相比，新生皮肤具有被毛稀疏并具光泽的明显不同特性，即为包裹未来鹿茸的茸皮。鹿角脱落2d～3d后，角柄伤口愈合已接近中期，中央为新生茸皮围绕的结痂；3d～4d后，伤口愈合接近晚期，中央部的结痂进一步缩小；4d～5d后，伤口愈合达到末期，中央部的结痂几乎全部消失。这种巨型伤口不仅能在5d左右的时间完全愈合，而且几乎是无伤疤的完美愈合。角柄的伤口愈合现象令人吃惊。对茸皮和角柄皮肤所进行的组织学比较研究[36，37]表明，茸皮具有比角柄皮肤更厚的表皮层和更大且多叶的皮脂腺，具有不同发育阶段的毛囊组织，但不具汗腺和竖毛肌。另外，茸皮血管的管壁更厚，管腔更小，神经纤维与角柄的基本相同。因此，虽然茸皮与角柄皮肤存在明显差异，但茸皮应当属于一种正常有序的生理皮肤，而不是一种伤疤(以Ⅰ型胶原纤维为主的无序组织)。所以，鹿茸再生早期的伤口愈合应该是名副其实的无伤疤伤口愈合。研究表明，鹿茸再生早期之所以能够实现快速无伤疤伤口愈合是由于角柄骨膜的存在[37]。如果在伤口愈合开始前将角柄骨膜剔除，角柄皮肤会沿着角柄骨干向近心端收缩，暴露出末端无骨膜的角柄骨质突，导致角柄末端伤口愈合失败；如果用缝合线收紧角柄末端皮肤以阻止角柄皮肤收缩，可促进该伤口愈合，但愈合的最终结果是伤疤；如果只切开角柄皮肤，但不剔除角柄骨膜，不但完成了无伤疤伤口愈合，而且再生出了一个多分支的鹿茸。这个结果证明了角柄骨膜是导致无伤疤伤口愈合的关键组织。要想使角柄伤口无伤疤愈合模型有效地应用于再生医学，必须清楚无伤疤伤口愈合是角柄皮肤的固有特性还是后天获得的属性。为此，Li等进行了角柄骨膜移植试验，结果移植的骨膜使异位正常皮肤(不具备无伤疤伤口愈合的能力)获得了无伤疤伤口愈合的能力。因此证明，角柄皮肤无伤疤愈合的能力是由角柄骨膜诱导后获得的，而不是先天固有的。同时，研究还证明了角柄骨膜分泌的诱导物质不具有种的特异性，其不仅对鹿的皮肤有效，对大鼠的伤口愈合速度和愈合质量也有明显改善。给药12d后，处理组伤口愈合已达96%且无明显伤疤，而对照组愈合面积仅为76%并具有明显伤疤。这一发现有可能为治疗如糖尿病人的伤口等慢性难愈合的伤口开辟新的候选药物。

4 鹿体骨骨质疏松/矿物质沉积模型

鹿茸在快速生长过程中，骨组织的生长需要大量的矿物质。在生茸骨化期，鹿体骨主要骨骼中的矿物质会发生剧烈地变化，在7月份驯鹿鹿茸快速生长阶段，其肋骨是多孔的、活跃的，并有高的流通率，经历着骨损失，这些损失最后在鹿茸生长停止时得到补偿。鹿体内发生脱矿作用越大的骨骼，在茸角骨化后恢复过程亦发生得越强烈。Banks研究发现，黑尾鹿在鹿茸生长季节出现相似的情形，并将其描述为生理性骨质疏松[20]。黑尾鹿在鹿茸生长和骨化期内，无论饲料中矿物质多么丰富，其肋骨、掌骨和胫骨的外层密质骨都经历一次周期性地疏松变化，这些骨骼的重吸收点均随茸角骨化的加快而明显增多，骨质密度显著下降。茸角完全骨化后，黑尾鹿体骨骼又会重新沉积矿物质，使已变得疏松的密质骨重新恢复到正常状态，说明茸角中沉积的矿物质除了部分来源于饲料外，主要来源于鹿体的骨骼，在茸角骨化结束后能很快从饲料中得到补偿。因此，对鹿周期性体骨骨质疏松及矿物质沉积机制的研究，有利于为人类骨质疏松疾病的治疗开辟新的突破口。

除此之外，鹿还有很多生物学特性可以作为研究模型来开发利用。如鹿的远缘杂交后代可育特性；鹿角脱落后，如此大的伤口在完全开放的鹿场条件下不感染发炎等特性。可见，鹿作为研究模型具有广阔的应用前景。

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