外泌体与鼻咽癌的研究进展*

鄢勤文 综述，黄光武△，何本超 审校

(1.广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,南宁 530021；2.湖北省天门市第一人民医院/湖北科技学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科 431700)

·综 述·

外泌体与鼻咽癌的研究进展*

鄢勤文1综述，黄光武1△，何本超2审校

(1.广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科,南宁 530021；2.湖北省天门市第一人民医院/湖北科技学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科 431700)

鼻咽肿瘤；疱疹病毒4型，人；外泌体

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方高发的恶性肿瘤，严重危害人民的生命和健康。目前研究认为:遗传易感性、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)和环境因素是其主要病因。几乎所有未分化和低分化鼻咽癌与EBV潜伏感染有关[1]。 EBV的潜伏感染和转化细胞的能力被认为是鼻咽癌致癌的基础，但是其作用机制有待进一步阐明。外泌体(Exosomes)是一种起源于细胞内涵体的小囊泡，其直径为40～100 nm，最初被认为是细胞的垃圾[2]。随着研究的深入，外泌体与肿瘤的关系及在病毒感染和致病过程中的作用逐渐被发现和认识[3-4]。来源于EBV感染细胞的外泌体在EBV的潜伏感染和致病过程中可能扮演着很重要的作用。而鼻咽癌作为一种与EBV密切相关的肿瘤，其外泌体的研究可能对阐明鼻咽癌的致病机制具有较大价值。

1 外泌体的特点及与肿瘤的关系

自发现以来，外泌体的特性和功能逐渐被人们所发现和认识[5]。研究表明外泌体携带功能性蛋白、mRNA和miRNA到邻近或远处的靶细胞，调节其免疫功能，在血管生成，细胞增殖，肿瘤浸润和细胞间的信息交流中起重要作用[6]。外泌体可以被细胞通过内吞作用摄取，或识别细胞表面的特异性靶向细胞并与细胞的胞膜融合，同时释放mRNA和miRNA等进入细胞质[7]。

肿瘤细胞来源的外泌体可通过改变肿瘤的微环境，释放自身携带的细胞因子等多种方式影响肿瘤的生长。外泌体主要从以下几个方面影响肿瘤的生长：(1)抗肿瘤免疫及抑制免疫功能并介导肿瘤免疫逃逸[3]；(2)诱导肿瘤血管新生并促进肿瘤转移[3]；(3)介导肿瘤细胞的化疗抵抗[7]。目前，在多种肿瘤患者体液中发现了外泌体，并具有肿瘤标志物的特点[8]。肿瘤外泌体的临床应用将为肿瘤的诊断和治疗提供新的策略。

2 外泌体与鼻咽癌

2.1 EBV相关外泌体 EBV是双链DNA病毒，属γ疱疹病毒科，人类是EBV的惟一宿主。EBV在感染过程中，可产生大量病毒基因编码产物，帮助病毒逃避宿主免疫攻击，为病毒繁殖创造有利的微环境[9]。外泌体整合EBV编码的RNA、miRNAs和蛋白等产物，作为细胞间的信使操纵感染的微环境并维持EBV的潜伏感染状态[6]。 这里把这些整合有EBV编码产物的外泌体统称EBV相关外泌体。下面就其整合的产物分别做一介绍。

2.1.1 膜潜伏蛋白LMP1和LMP2A 2006年Keryer 等[10]首次在EBV感染的鼻咽癌细胞系外泌体中检测到了LMP1。此外在鼻咽癌患者的血液和唾液里也发现了载有LMP1的外泌体[11-12]。2010年Meckes等[6]也在EBV感染的鼻咽癌细胞系外泌体中检测到了丰富的LMP1，LMP1+外泌体与EBV阴性细胞共培养使其EGFR表达上调。EBV阴性细胞与LMP1+和EGFR+外泌体共培养时细胞内吞这些囊泡并且引起 ERK和PI3K/AKT信号通路的激活[6]。 LMP2A也被发现存在于EBV外泌体中。Ikeda等[13]从EBV转化的淋巴细胞系(LCLs)外泌体中检测到了LMP2A。他们用破坏脂筏的药物甲基-β-环(MCD)处理细胞膜出现胆固醇消耗，这能使细胞LMP2A的整体水平以及被外泌体整合的LMP2A水平增加。此外，还发现用MCD处理后细胞裂解液中LMP2A的磷酸化和泛素化作用明显减少；但是对于外泌体中的LMP2A，只有磷酸化作用受到了抑制。这说明磷酸化作用在病毒蛋白和宿主蛋白被外泌体选择性整合过程中可能有重要作用。

2.1.2 EBV感染裂解期蛋白 gp350 和dUTPase EBV gp350是EBV裂解性感染晚期表达的一种结构蛋白。Vallhov等[14]在来源于EBV转化的LCLs的外泌体中检测到了gp350，并且发现这些gp350+外泌体能黏附到未感染EBV的B细胞上。他们在体外证明了来源于LCLs的外泌体限制EBV感染。另一项研究发现gp350+外泌体，能被慢性淋巴细胞白血病细胞内化，使EBV特异性CD4+T细胞激活，引起强烈的细胞毒性反应[15]。EBV编码的脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)是新发现的EBV感染裂解期的早期蛋白。研究已经表明，EBV编码dUTPase在先天/适应性免疫方面具有不依赖于其酶活性的功能，部分原因在于它能够通过刺激toll样受体(TLR2)进而活化NF-κB,诱导炎症相关细胞因子分泌[16]。进一步的研究表明EBV编码的dUTPase显著改变参与肿瘤发生、炎症和病毒防御机制基因的表达，并且发现其诱导人类树突状细胞TH1 和TH17 细胞因子的分泌[17]。更有意思的是经化学诱导的Raji细胞外泌体分泌包含EBV编码的dUTPase，并且激活外周血单核细胞及树突状细胞的NF-κB转录因子和促使多种细胞因子的分泌增加[17]。

2.1.3 EBV miRNAs,EBV mRNA和EBERs Pegtel等[18]首先发现了病毒miRNA被外泌体运送到未感染的细胞 ，他们在EBV感染的B细胞外泌体中证明了BHRF1 miRNAs的存在，并且发现含有BHRF1 miRNAs的外泌体靶向于邻近未感染EBV B细胞的CXCL11/ITAC基因。此外，他们还在无症状艾滋病毒感染患者(这些患者带有较高的EBV-DNA载量)非B细胞中发现含有升高水平的EBV miRNA，表明在体内外泌体明显地转移miRNA到未感染EBV的细胞。随后在鼻咽癌细胞系外泌体上的研究证明了这一结论。Gourzones等[12]在移植了人鼻咽癌细胞的小鼠血清外泌体中检测到了EBV miR-BARTs并发现鼻咽癌患者的血清中也含有BART miRNA。 Meckes等[6]进一步在鼻咽癌细胞系分泌的外泌体上证明了某些富集的BART-miRNA的存在。近期，另有两个组分别在EBV相关胃癌和鼻咽癌外泌体中也发现了BART miRNAs[19-20]。目前研究证明，在外泌体中发现的两个以NLRP3 3′-UTR 为靶点的EBV编码miRNAs(miR-BART15和miR-BART15-3p)有很重要的功能。miR-BART15被外泌体转运到靶细胞调节NLRP3蛋白表达，从而抑制炎症小体的活性[21]。miR-BART15-3p则发现存在于起源于EBV感染的胃癌细胞系外泌体中,含有miR-BART15-3p的外泌体被未感染细胞内吞后增加其凋亡[19]。 Andrea等[22]发现EBV外泌体中存在EBV编码的潜伏期mRNAs。共有4种潜伏期基因表达的mRNA(Ebna1，Ebna2，Lmp1，Lmp2)在EBV阳性细胞外泌体中被检测到[22]。EBERs是EBV潜伏感染的标志物,近期有研究者发现EBERs可能通过外泌体分泌[23]。La蛋白是一个能与EBER-1绑定的蛋白[23]，故推测EBERs很可能以EBER-La复合体的形式被外泌体分泌到感染细胞外[23]。

2.2 鼻咽癌的其他外泌体 除了EBV编码的产物可以被整合进入外泌体外，宿主功能物质也能进入外泌体，目前在鼻咽癌外泌体中报道的宿主蛋白主要有半乳糖凝集素9(galectin9)。半乳凝素9是β-半乳糖凝集素，Keryer和klibi等先后在HLA-Ⅱ+外泌体中发现了galectin9[10-11]。前者在鼻咽癌移植瘤上皮细胞释放的HLA-Ⅱ+外泌体中发现galectin9。后者使用抗HLA-Ⅱ的磁珠从鼻咽癌患者的血浆中捕获特异性的外泌体，这些外泌体中包含有高浓度的galectin9，然而在对照组则没有检测出。研究证明，LMP1丰富的外泌体也增加外泌体中galectin9的水平，两种蛋白同时出现在外泌体时减少外周血T细胞的凋亡。然而外泌体中单独出现其中一种蛋白时，LMP1(0.17 nM)对比galectin9(46 nM)具有一个更低的IC50，说明外泌体中LMP1的抗凋亡与galectin9关系不大[10]。进一步的研究发现起源于一个不同EBV感染的鼻咽癌克隆LMP1-且galectin9+的外泌体明显增加对来自健康EBV携带者的EBV反应性 CD4+ T细胞的凋亡作用[11]。

2.3 外泌体在鼻咽癌中的作用

2.3.1 维持EBV潜伏感染 EBV虽然已被发现超过50年，然而其感染和致病机制仍未阐明。外泌体维持EBV潜伏感染[6]，这可能是EBV在鼻咽癌发生发展过程中的作用机制之一。外泌体对EBV感染的调控可能主要是通过携带和运输病毒编码产物和宿主功能蛋白，调控EBV免疫逃避，维持其潜伏感染。鼻咽癌外泌体中丰富的LMP1的抗T细胞凋亡作用与galectin9的促T细胞凋亡作用可能是EBV逃避免疫监视，维持潜伏感染的一对机制[10-11]。目前研究还发现，包含有gp350的外泌体通过CD21选择性的结合B细胞阻止EBV的感染[14]。LMP1+外泌体被B细胞内化后不仅增加B细胞的凋亡而且引起B细胞向浆母细胞的方向分化[24]。Ye等[25]发现鼻咽癌细胞系TW03来源的外泌体通过抑制T细胞的增殖和TH1和TH17细胞的分化以及促进调节性T细胞的诱导来损伤T细胞的功能。这些研究结果提示鼻咽癌外泌体通过改变T细胞的增殖，分化，细胞因子的释放来诱导T细胞功能障碍(包括特异性和非特异性免疫反应)。

2.3.2 促进鼻咽癌发生和演进 外泌体能释放自身细胞因子等物质，作用于内皮细胞膜表面受体，导致血管形成并促进肿瘤的迁移[7]。Nanb等[26]发现LMP1+外泌体能改变鼻咽癌细胞间黏附分子ICAM-1的表达水平，引起细胞表型的改变。LMP1通过外泌体促进鼻咽癌细胞成纤维细胞生长因子2(FGF-2)的分泌，外泌体中有活性的FGF-2可能促进鼻咽癌血管生长[27]。转录活性的缺氧诱导因子1-α(HIF1-α)也被发现通过外泌体的内吞和胞吐作用从LMP1+的鼻咽癌细胞中分泌出来然后进入邻近细胞改变钙黏素的表达水平，从而影响上皮间质转化[28]。研究者对鼻咽癌患者血清和鼻咽癌细胞外泌体中普遍过度表达的5种miRNA(HSA-MIR-24-3p、HSA-MIR-891a、HSA-MIR-106A-5P、HSA-MIR-20A-5P和HSA-MIR-1908)进行了鉴定分析，发现这些过表达的miRNA簇下调MARK信号通路从而改变细胞的增殖和分化[25]。目前已发现32种miRNA与鼻咽癌有关，miRNA参与鼻咽癌肿瘤细胞的增殖、凋亡、黏附、血管生成等生物学过程的调控，在肿瘤形成中也发挥重要作用[29]。在鼻咽癌中外泌体与miRNA调控作用的关系还需要进一步的研究。

2.3.3 外泌体可作为鼻咽癌的生物标志物 肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到周围环境中去，而且外泌体能在4 ℃保存96 h，在-70 ℃下保存更长时间[30]。临床可以通过检测血清，尿液和唾液等体液中外泌体的相关分子的改变，对疾病进行诊断和监测[31]。鼻咽癌患者血浆中能持续检测到肿瘤外泌体[10]。此外，鼻咽癌患者血清中外泌体浓度的增加与鼻咽癌晚期淋巴结转移和预后不良密切相关[25]。值得注意的是，鼻咽癌外泌体具有高含量HLA-Ⅱ分子[10]，使用抗HLA-Ⅱ的磁珠捕获是一个从鼻咽癌患者血浆中采集肿瘤外泌体的强大工具。因为在相同的实验条件下对照血浆样品中不会有外泌体被捕获[10]，所以这种方法捕获的鼻咽癌肿瘤外泌体具有良好的特异性。除了HLA-Ⅱ，鼻咽癌外泌体还具有高浓度的galectin9[11]，因此本文认为鼻咽癌外泌体适合作为生物学标志。

3 展 望

外泌体整合或者携带EBV编码的产物及宿主细胞内的功能性物质，逃避宿主机体免疫监视，从感染的细胞释放出来，可以被暴露其中的未感染细胞摄取。载有EBV编码产物的外泌体被未感染细胞内化后，激活多条细胞内信号通路，操控细胞的增殖和凋亡。EBV相关外泌体在EBV的潜伏感染以及致病过程中的作用可能在鼻咽癌的发生发展过程中扮演很重要的角色[32]。进一步了解EBV如何调控鼻咽癌外泌体的产生和功能可能有助于阐明EBV在鼻咽癌中致病的机制。外泌体在鼻咽癌免疫逃避机制中的探索可能将为鼻咽癌的免疫治疗开辟新道路。此外，鼻咽癌外泌体具有的肿瘤标志物的潜能及与预后的关系，将来可能被应用于指导鼻咽癌的临床诊断和治疗。当然，这些研究还处于初始阶段，外泌体是否能指导鼻咽癌的临床诊断和治疗以及被应用于鼻咽癌的筛查，还需要将来进一步的研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.044

国家自然科学基金资助项目(81260404)。

：鄢勤文(1987-)，硕士，主要从事鼻咽癌肿瘤生物学及综合防治的研究工作。△

，Tel:13607861288；E-mail:hgw1288@126.com。

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