小鹅瘟的琼脂扩散试验操作

小鹅瘟的琼脂扩散试验操作

吴洪涛1，吴佳宁2

(1.辽宁省重大动物疫病应急中心110000;2.沈阳市动物疫病预防控制中心110000)

琼脂扩散试验(AGP)是血清学沉淀试验的一种，以琼脂凝胶作为抗原抗体免疫扩散和形成沉淀反应的载体。琼脂凝胶的含水量在90%以上，能允许分子量在200000以下的大分子物质自由通过和扩散，绝大多数的可溶性抗原与免疫球蛋白的分子量都在200000以下，所以能在凝胶内自由扩散。若特异的抗原、抗体在凝胶中各以其固有的扩散系数扩散，当两者在比例最合适的区域内相遇，反应生成的沉淀物的颗粒较大，停留在凝胶中不再扩散，即发生沉淀反应形成不透明的白色沉淀线。小鹅瘟琼脂扩散试验，可用标准抗原检测血清抗体，亦可用标准血清检测GP抗原，前者阳性检出率为100%，后者检出率达50%以上。

1　实验仪器、设备及材料

标准GP抗原：将已知GPV种毒按1∶10稀释，接种于12～14日龄的无相应抗体的鹅胚尿囊腔内，0．2mL/只，继续孵化，每天照蛋，收集接种后72～120小时死亡胚，气室向上静置4℃冰箱4～12小时，收获尿囊液及具有典型病变的胚体，取l份胚体，2份尿囊液捣碎制成匀浆，加等量三氯甲烷(氯仿)震摇30min，以3500转/min离心30min，吸取上清液装入透析袋，包埋于干燥硅胶中越夜，至袋内溶液完全干燥，向袋内加入原液容量1/20的去离子水，使内容物溶解，即为沉淀抗原。

标准阳性血清：小鹅瘟高免血清。

被检抗原：无菌采取具有典型病变的患病雏鹅肝组织，捣碎加2倍量离子水，制备成组织悬液，参照制各标准GP抗原方法用氯仿处理硅胶包埋浓缩加入原悬浮1/20的去离子水为被检抗原。

被检血清：受检雏鹅血液自然析出的血清。

凝胶配方：琼脂糖：0.7～1.2g，氯化钠 8g，苯酚0.1mL，蒸馏水 100mL。凝集制备：将各种试剂依次加入后，用5.6%碳酸氢钠溶液调pH 值6.8～7.6，水浴加热使琼脂糖充分溶解。将溶化的琼脂凝胶倾注于清沽的玻板上或平皿，制成厚度约为3mm的琼脂凝胶板。注意不要产生气泡。打孔方法同马立克氏病琼脂扩散试验。

打孔：在制备好的琼脂凝胶扳上打孔，其打孔图形按需要而定，一般采用七孔梅花图形，操作时，先用一张与凝胶板大小相仿的白纸片，按要求画好打孔图形，然后，将图形放在凝胶板底下，用打孔器依样打孔。

2　实验步骤

方法一：用GB标准抗原检测受检血清GB抗体。用移液管吸取标准GB抗原加入中心孔内，外周任何两个相对孔加入GB标准阳性血清，其余各外周孔加入各被检鹅的血清，容量以平孔面为度，注意不要溢出孔外，不要有气泡，并记录点样顺序。所有样本加入完毕，放入湿盒35～37℃恒温中过夜，次日(24h)观察并记录结果。

方法二：用GB标准阳性血清检测GB抗原。用移液器吸取GB标准阳性血清加入中心孔内，外周任何相对的两孔加入标准GB抗原，其余外周孔分别加入受检鹅组织处理液，加入量以平孔面为度。注意不要溢出孔外，不要有气泡，并记录点样顺序。所有样品加完后，放入温盒置35～37℃恒温箱中过夜，次日观察并记录结果。

3　结果判定

若受检血清有GB特异抗体或受检组织含有GB病毒抗原，则在抗原与抗体孔之间产生肉眼可见的清晰的白色沉淀线，此为阳性反应。相反，如抗原、抗体之间不出现沉淀线则为阴性。

沉淀线一般出现在抗原抗体孔之中间，但有时由于抗原浓度与抗体浓度不一，沉淀线往往偏近抗原孔或抗体孔，有时可能出现一条以上的沉淀线，这些情况均属阳性反应。

如果被检孔没有出现白色沉淀线，但邻接的阳性对照孔的沉淀线末端向该被检孔内侧偏弯，可认为该被检孔样品为阳性：若邻近的阳性对照孔的沉淀线末端向该被检孔直伸或一向其外侧偏弯，或该被检孔虽然有沉淀线，但该沉淀线与阳性对照孔沉淀线交叉(属非特异性沉淀线)，则此被检样品为阴性。

理论上，大多数传染病都可应用AGP试验作检验，目前常应用AGP试验检测的家禽传染病还有鸡马立克氏病、传染性法氏囊病、家禽脑脊髓炎、病毒性关节、滑液囊霉形体病、禽流感、禽霍乱等，基本原理和方法同上，具体操作可按试剂说明书进行。